单细胞视角下的“基因变阻器”：揭秘miRNA调控
单细胞视角下的“基因变阻器”：揭秘miRNA调控
微小RNA（miRNA）是基因表达的关键调控因子，在生理和病理生理状态下控制细胞功能。miRNA在疾病、压力和发育中发挥着重要作用，目前正在研究其治疗方法。在生物发生过程中miRNA会进化产生miRNA异构体（isomiR），从而进一步使miRNA基因调控多样化。单细胞RNA测序（scsRNA-seq）技术与计算策略相结合，可以在细胞水平上探索miRNA、isomiR和互作RNA。通过与其他miRNA相关的单细胞模式相结合，可以在不同的加工和调控阶段刻画miRNA角色。最近，发表在《Trends in Genetics》的综述论文讨论了（i）测量miRNA和isomiR丰度的单细胞实验技术，以及（ii）分析它们的计算机方法，以研究miRNA生源和转录后调控机制。
单细胞RNA测序对于理解miRNA调控至关重要
单细胞测序技术可以确定每个细胞中的RNA分子丰度，并可以解决单个细胞之间的转录组变异性问题。单细胞多模态组学技术和单细胞空间技术可以捕获细胞间基因表达变异性、RNA动力学和细胞间通讯，并带来新的挑战和局限性。基因表达变异性部分可由miRNA活性、其调控基因或相互作用组、相关信号和其他未知调控因子的变化所解释。这种变异性决定了细胞状态，并有助于特定于细胞类型的miRNA调控。RNA捕获化学的发展以及从单个细胞中RNA回收率的提高使得能够测量与miRNA和isomiR及其相互作用因子相关的多种模态。
研究单细胞中miRNA实验检测技术
在单细胞分辨率下研究miRNA和其他小RNA需要细胞分离策略，然后进行实验分析以提取目标小RNA和/或其RNA相互作用物，然后进行文库构建和分析（图1）。实验分析将短寡核苷酸或接头连接到细胞悬浮液中的目标RNA分子上，然后选择性捕获以测量RNA。识别miRNA靶标的创新技术包括将催化RNA编辑的蛋白质与miRNA引导蛋白融合，然后分离靶标复合物。
图1 在单细胞水平上研究微小RNA（miRNA）调控的实验策略。（A）单细胞小RNA测序（scsRNA-seq）可识别单个细胞中的小RNA，并能够估计miRNA和其他小RNA的丰度。（B）测序方案可以对手动移液的细胞同时使用小RNA测序和Smart-seq文库构建，也可以对通过FACS分类的细胞使用Smart-seq-total来测量单细胞中的miRNA和mRNA的共丰度。（C）改进的空间转录组学使用原位多聚腺苷酸化，并在单细胞空间分辨率下生成非poly（A）读数以用于miRNA丰度和poly（A）长读数以用于mRNA丰度。（D）AgoTRIBE根据mRNA编辑事件识别与miRNA相互作用的mRNA。miRNA臂引导AGO2蛋白至目标mRNA并诱导ADAR2介导的RNA编辑，因为ADAR2蛋白与AGO2融合。ADAR2介导的RNA编辑引入了A到G的替换，从而确定大致的miRNA结合位置。该检测还以单细胞分辨率量化了mRNA丰度
miRNA和isomiR特征和丰度
miRNA转录本的加工导致成熟miRNA及其产生isomiR。尽管实验检测可以识别miRNA及其相关模式，但计算策略（图2）可以量化miRNA和isomiR、解决错误和测序偏差、研究影响miRNA丰度的相关因素，并在没有scsRNA-seq的情况下预测miRNA的表达。
图2 使用单细胞小RNA测序(scsRNA-seq)数据来量化微小RNA(miRNA)和其他miRNA形式(isomiRs)的计算方法。(A)miRNA量化工作流程，用于从scsRNA-seq数据中估计miRNA丰度。读取被映射到注释的成熟miRNA序列，并将读取与主要miRNA序列的映射用于isomiR量化。此后，可以对细胞中的miRNA/isomiR进行优先排序，根据miRNA表达对细胞进行聚类，并进行差异表达分析以查找在细胞簇或细胞条件之间有显著差异的miRNA。(B)使用在已知miRNA靶标相互作用和配对的bulk小RNA和RNA-seq表达谱上训练的模型来预测单细胞miRNA表达，然后将其应用于单细胞RNA测序(scRNA-seq)数据
探索miRNA靶标调控的计算策略
多模态单细胞测量可捕获与其调控作用相关的miRNA。AgoTRIBE检测与scRNA-seq共同恢复与单个细胞中miRNA-mRNA调控关系。scRNA-seq和scsRNA-seq使我们能够跨细胞研究miRNA对基因表达变异的调控作用。随着RNA-seq技术的发展，计算策略（图3）可以精确地揭示miRNA对信号通路的调控作用。
图3 从单细胞数据研究miRNA介导的转录后调控的计算策略。(A)使用配对单细胞数据或Smartseq-total在单细胞中测量miRNA和mRNA表达。可以使用这两种方法进行下游分析，包括聚类、轨迹分析、推断miRNA基因调控以及miRNA与其靶标之间的成对相关性。(B) AgoTRIBE和单细胞RNA测序(scRNA-seq)的整合用于将miRNA与其靶标转录本关联，从而推断miRNA调控。读取中的A到G和T到C替换可用于推断miRNA靶标，而包含已知SNP的读取则被排除在外（假设SNP未被ADAR2编辑）。这些读取与mRNA表达一起用于回归分析，以推断与它们结合的miRNA。AgoTRIBE的效率是通过与CLIP识别的结合位点进行比较来衡量的，因为在细胞水平上目前没有实验验证的miRNA靶标。（C）使用多聚腺苷酸化RNA测序数据推断多聚腺苷酸化(pA)位点，并在两种条件下研究miRNA结合在poly(A)转录本中的重要性。（D）使用统计模型和模拟来建模miRNA调控的基因表达噪声，其中考虑了mRNA降解率和转录率等各种因素
总结与展望
miRNA和isomiR具有巨大的潜力，可以精准调控基因表达，从而介导重要的细胞功能。灵敏的scRNA-seq检测和匹配模式的开发使人们能够捕获小RNA及其调控分子的丰度，但需要计算方法来分析它们。与scRNA-seq集成的转座酶可及染色质单细胞检测(scATAC-seq)已用于识别miRNA基因附近的差异开放染色质区域、肾脏发育和与太空辐射相关的miRNA特征。这些研究引发了与miRNA基因转录的表观遗传调控有关的假设。
RBP介导的初级/前体miRNA替代加工生成isomiR。然而，与miRNA相比，isomiR的功能作用仍不清楚。在转录后水平上，观察到的细胞质miRNA表达与细胞核中APA动态的关联表明miRNA生物合成机制和靶转录本APA位点相关。miRNA将特定的RBP募集到靶mRNA相互作用位点。然而，RBP在基因抑制中的作用尚不完全清楚。了解miRNA生物合成过程中的miRNA-RBP依赖性可能有助于避免miRNA疗法的脱靶效应。然而，确定miRNA与isomiR和RBP的关联及其在细胞异质性中的作用将需要开发捕获多种模态的方法。
单细胞测序技术为研究细胞在时间和空间上的异质性开辟了一个新维度。单细胞miRNA测量和活体成像可以区分亚细胞区域，使用荧光蛋白识别mRNA衰变，并在对细胞培养的干扰最小的情况下捕获多个miRNA的活性。捕获模板化和非模板化的isomiR需要灵敏的策略，例如AQ-seq和靶向测序。改进的序列连接化学与蛋白质融合化学相结合，例如基于AgoTRIBE的方案和计算方法将miRNA/isomiR与其相互作用的靶位点联系了起来。在卵母细胞到胚胎的转变过程中，miRNA保真度已经得到量化，凸显了isomiR多样性的重要性。精准了解miRNA调控及其细胞机制在应激或发育过程中的变化，将有助于开发基于miRNA的治疗方法和个性化医疗方法。
Smart-seq2-total和STRS等检测方法面临挑战（例如RNA长度较短和接头偏差），这会降低miRNA和非poly(A)小RNA的定量灵敏度。因此，在单细胞中以空间分辨率直接定量miRNA仍然是一项尚未解决的挑战，因此只能通过其他方法推断空间miRNA活性图。对于单细胞RNA测序方法，与空间转录组学的结合显著提高了我们对发育、体内平衡和疾病中细胞亚群的了解。因此，开发能够以空间分辨率量化miRNA、isomiR和非poly(A) RNA的敏感检测方法将能够在共同的空间域中与单细胞空间转录组学进行整合。
灵敏的scsRNA-seq与长读测序技术相结合，可以研究miRNA对转录本加工的影响。此类其他模式的可用性需要开发计算方法来(i)解决技术引入的测序错误和偏差，(ii)整合模式以得出合理的生物学结论并建立参考图谱，以及(iii)从整合的模式中预测miRNA/isomiR活性。开发单细胞组学分析和测序技术以精确量化miRNA和miRNA相关分子，以及开发计算方法来应对各自模式带来的挑战，将提高我们对miRNA在细胞中的精准调控功能理解。
关于这个领域几个悬而未决的问题
- 我们如何有效地设计连接接头以在单细胞水平上捕获小RNA？
- 我们能否开发检测方法来捕获mRNA相互作用位点的miRNA和isomiR靶标？
- 我们能否在单细胞水平上解析miRNA/isomiR生物合成过程中的RBP介导调控或它们的靶标相互作用？
- 我们能否开发计算策略来整合单细胞模态以追踪应激、发育或疾病进展时的细胞状态转变？
- 我们能否开发人工智能模型来查询单细胞模态如何相互作用以调控细胞状态的变化？
从“基因暗物质”到“细胞指挥官”，miRNA研究的每一次突破都在重塑生命科学的认知边界。随着编码和非编码单细胞技术与人工智能的深度融合，开启精准医疗的“黄金时代”已经逼近。