人辅助性T细胞（Th）亚群分化方案及细胞因子的选择

人辅助性T细胞（Th）亚群分化方案及细胞因子的选择

辅助性T细胞（T helper cell，Th）是免疫系统中的重要组成部分，由初始CD4+ T细胞在特定刺激下分化而来。根据分泌的细胞因子谱不同，Th细胞可分为多个亚群，包括Th1、Th2、Th17、调节性T细胞（Treg）、Th9、Th22和Tfh细胞。每个亚群都有其独特的功能和作用机制。本文将详细介绍这些Th细胞亚群的特征及其分化方案。

图1.CD4+ T 细胞及其亚群

Th1 细胞

Th1细胞的主要效应功能在于细胞免疫和炎症，包括活化其他免疫细胞如巨噬细胞、B细胞和CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的细胞溶解和其他效应功能。此外，Th1细胞在活化CD8+细胞毒性T细胞、促进其靶向杀伤肿瘤细胞中发挥重要作用。

Th1细胞表面标志物：CD3、CD4、CD28、CD44、CD45R、IFN-γR1以及CXCR3等。

Th1分泌的细胞因子：IFN-γ、TNFα、GM-CSF、IL-3、LT-α、LT-β、CXCR-3、CCL-2等。

Th2 细胞

Th2可分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13和IL17E等细胞因子，这些细胞因子能促进Th2细胞的增殖，进而辅助B细胞活化，从而促进B细胞的增殖、分化和抗体的生成，发挥体液免疫的作用。同时，这些细胞因子可抑制Th1细胞增殖。Th2细胞表面相对选择性表达趋化因子受体 CCR3、CCR4、CCR8 和CRTh2。

Th17 细胞

Th17 细胞其特征性转录因子为 RORgt，可分泌 IL-17A、IL-17F、IL-21 和 IL-22，细胞表面高表达IL-23R和趋化因子受体CCR6、CCR4。微环境中TGF-β和IL-6可促使初始CD4+ T细胞分化为 Th17 细胞，并抑制其向 Th1和Th2细胞分化。IL-6/IL-6R 信号可激活 STAT3，启动分化过程，并诱导 RORgt、IL-17 和 IL-23R 表达。IL-21和IL-23可促进Th17细胞分化并分泌IL-17和IL-22。

Th17细胞是最早参与抗感染免疫的效应性T细胞。机体感染李斯特菌、沙门菌、弓形虫、隐球菌、利什曼原虫等病原体后，DC 最早合成 IL-6和TGF-β，诱导初始T细胞分化为 Th17 细胞。Th17 细胞在抵御胞外细菌感染(尤其在与大量病原体直接接触的肠道、呼吸道黏膜)发挥重要作用。

Th9 细胞

Th9 细胞因其可分泌大量IL-9而命名为Th9细胞。在微环境中TGF-β和IL-4共同作用下，可诱导初始T细胞分化为Th9细胞。另外，TGF-β也可单独诱导Th2细胞分化为Th9细胞。Th9细胞也可分泌IL-10，但该亚群并无免疫抑制效应。

Th22 细胞

Th22 细胞参与某些慢性炎症性疾病( 如牛皮癣、哮喘症) 发生。该细胞分泌 IL-22、不分泌 IL-17和IFN-γ。该细胞可由记忆性T细胞(CD45RA- )分化而来，也可由pDC、IL-6和TNF诱导初始CD4+ T细胞分化而来。

Tfh 细胞

Tfh细胞表型为CD4+ CXCR5+ CCR7- ，并高表达共刺激分子 ICOS、PD1。Tfh 细胞的特征性转录阻抑蛋白为 BCL-6，可通过分泌 IL-21和IL-4等影响B细胞分化和抗体产生。淋巴结T细胞区的并指状DC (interdigitating DC)表面 pMHC 与初始 CD4+ T细胞TCR高亲和力结合，可启动 CD4+T 细胞分化为Tfh 细胞。

调节性T细胞（Treg细胞）

该类细胞可对免疫应答进行精细的负调节，按其起源可分为天然型 Treg (natural Treg, nTreg)和诱导性 Treg 细胞(induced/inducible Treg, iTreg)。

nTreg表型特征为：CD4+ CD25+；表达 CTLA4、GITR等；不表达CD69(T细胞活化的表面标志)， 不表达或仅低表达 CD127(IL-7R)。该细胞是一类可发挥负调节作用的CD4+CD25+T 细胞亚群，nTreg可抑制CD4+T、CD8+ T细胞增殖和分泌细胞因子，并抑制 DC和单核细胞功能。

iTreg由在IL-2和TGFβ存在下，用抗CD3刺激naive CD4+T细胞。

人辅助性T细胞亚群分化方案

配置培养基试剂准备

1640培养基、血清（胎牛）、双抗、L-谷氨酰胺、β-巯基乙醇。

培养基配置

RPM-1640+10%胎牛血清+1mML-谷氨酰胺+55μM β-巯基乙醇+双抗。

细胞准备

分选出Naive CD4+ T cells(CD4+ CD25- CD44lowCD62Lhigh)

细胞刺激培养

1. CD3包板

包板浓度 2μg/ml（96孔板加50μl，48孔板加200μl）；
加入上述体积后4℃过夜包被，包被后弃去孔内液体，PBS洗板2次。

2. 分选的Naive CD4+ T cells 加入包被孔内

a) 96 孔板加入 1×105 细胞（200μl培养体系）
b) 48 孔板加入 2×105 细胞（500μl培养体系）

3. 配置分化培养基

4μg/ml anti-Human CD28 + 10ng/ml Human IL-2

根据需要分化的方向额外添加以下成分：

1. Th1细胞: IL-12 (50 ng/mL) + anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
2. Th2细胞: IL-4 (50 ng/mL) + anti-human IFN-γ (10 µg/mL)；
3. Th17细胞: IL-6 (50 ng/mL), IL-1β (10 ng/mL), IL-23 (10 ng/mL), TGF-β1 (10 ng/mL) + anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
4. iTreg细胞: TGF-β1 (10 ng/mL) + anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
5. Th9细胞: IL-4 (50 ng/mL), TGF-β1 (10 ng/mL),+ anti-human IFN-γ (10 µg/mL)；
6. Th22细胞: IL-6 (50ng/mL), IL-23 (50ng/mL), + anti-human IFN-γ (10 µg/mL) and anti-human IL-4 (10 µg/mL)；
7. Tfh细胞: IL-6 (50ng/mL), IL-21 (10ng/mL), CXCL13 (10ng/mL)。

细胞培养分化

细胞培养分化3-5天，培养过程中若培养液上清变黄，更换培养基，一般建议半量换液，根据培养经验，一般是隔天换液。

培养分化后鉴定（胞内染色）

分化后的细胞加入20 ng/ml PMA , 1μg/ml Ionomycin 刺激30 min 后，加入10 μg/ml BFA 阻断，继续培养3.5 h 后收集细胞进行流式检测。

细胞鉴定

使用相应的流式抗体及辅助试剂进行胞内染色鉴定。

细胞分化所需细胞因子推荐

参考文献：

[1] Amrita B,Ganesan R,Gabriella A, et.al. Differentiation and Regulation of TH Cells: A Balancing Act for Cancer Immunotherapy.Front. Immunol., 03 May 2021.