细胞培养过程中污染的预防与解决办法

细胞培养过程中污染的预防与解决办法

细胞培养是生物医学研究中的重要技术，但污染问题一直是困扰研究人员的难题。本文将为您详细介绍细胞培养过程中污染的分类、预防措施以及具体的处理方法，帮助您更好地开展细胞培养工作。

一、细胞污染

细胞污染是细胞培养过程中面临的常见问题，可分为微生物污染（如细菌、真菌、支原体污染、黑胶虫、病毒）和细胞交叉污染。

少量细胞污染

• 个别培养器皿污染：操作问题
• 不同批次细胞污染：试剂、操作、实验服等
• 相同批次细胞污染：复苏或冻存污染

大量细胞污染

• 共用试剂、耗材：考虑试剂污染
• 未共用试剂、耗材：培养箱、水浴锅、水盘、细胞房

二、预防措施

（1）实验环境清洁

• 定期使用消毒剂（如 75% 酒精、新洁尔灭等）对细胞培养间的地面、台面进行擦拭消毒，每天实验前开启紫外灯照射 30 分钟以上，以杀灭空气中和物体表面的微生物。
• 超净工作台在每次使用前需用酒精擦拭台面，并开启风机和紫外灯进行消毒，确保操作区域处于无菌状态。

（2）实验器材处理

• 玻璃器皿如培养瓶、吸管等，需经过清洗、烘干后，采用高压蒸汽灭菌法，在 121℃、15-20 分钟的条件下进行灭菌处理，以杀灭可能存在的微生物。
• 耗材如培养板、枪头等，应选用无菌包装的产品，若有必要，可再次进行紫外线照射消毒。

（3）细胞与试剂质量把控

• 购买细胞时，选择正规、有资质的细胞库或供应商，确保细胞的质量和无菌状态，收到细胞后，应及时进行支原体等检测。
• 血清、培养基等试剂要从可靠渠道购买，使用前需进行无菌检测，可采用过滤除菌的方法，将培养基等液体通过 0.22μm 或 0.45μm 的滤膜过滤，以去除其中的微生物。

（4）人员操作规范

• 实验人员进入细胞培养间前，需更换无菌工作服、鞋套，佩戴口罩、帽子，并用肥皂或洗手液彻底清洗双手，再用酒精擦拭消毒。
• 在超净工作台内进行细胞操作时，动作要轻缓，避免剧烈晃动引起空气流动，造成污染，同时，所有操作要在酒精灯火焰附近的无菌区域内进行。

三、处理方法

（1）细菌污染

• 对于珍贵细胞，可尝试使用含有高浓度抗生素的培养液进行处理，如青霉素、链霉素、庆大霉素等，根据污染细菌的种类和药敏试验结果选择合适的抗生素，处理一段时间后，再用不含抗生素的培养液进行培养，观察细胞生长情况。
• 若细胞污染严重，无法挽救，应及时丢弃受污染的细胞及相关器材，并用消毒剂对培养箱、超净工作台等进行彻底消毒。

（2）真菌污染

• 可使用抗真菌药物如两性霉素 B、制霉菌素等进行处理，将药物加入到细胞培养液中，作用一定时间后更换培养液，观察细胞状态。
• 用 75% 酒精擦拭培养箱、超净工作台等表面，去除真菌孢子，防止污染扩散。

（3）支原体污染

细胞培养中最常见最难发现的一种污染是支原体污染，针对支源体污染，海星生物推出的支必清支原体清除试剂盒，经验证，可有效去除莱氏无胆甾原体（Acholeplasmalaidlawii）、精氨酸支原体（Mycoplasmaarginini）、猪鼻支原体（Mycoplasmahyorhinis）和口腔支原体（Mycoplasmaorale）等支原体。在动物细胞培养中，这些支原体菌株占污染的85%以上。支原体污染验证的细胞株常会出现大量黑色颗粒，称为黑胶虫。按照说明书使用这些试剂处理细胞，通常需要连续处理几个周期，每个周期后进行支原体检测，直至检测结果为阴性。对于污染严重且无法用药物清除的细胞，应果断丢弃，同时对实验环境和器材进行全面消毒。

（4）细胞交叉污染

• 若发现细胞存在交叉污染，应立即停止使用受污染的细胞株，对剩余的细胞进行 STR 分型等鉴定，确定细胞的真实身份。
• 重新复苏正确的细胞株，确保细胞培养体系的独立性，避免不同细胞株之间的交叉污染，在后续的细胞培养过程中，加强细胞身份验证和监控。