mRNA Display技术，探索蛋白类药物研发新前沿

mRNA Display技术，探索蛋白类药物研发新前沿

mRNA展示技术是一种新兴且强大的体外多肽筛选技术，其核心是借助嘌呤霉素形成mRNA-蛋白质复合物，将多肽表型筛选与基因型直接联系起来，广泛应用于高亲和力结合肽的筛选。本文将深度解析mRNA展示技术这一创新筛选技术的工作原理与优势，揭示这一前沿技术如何助力多肽及蛋白类药物的筛选与发现。

在分子生物学的世界里，科学家们一直在寻找新的方法来研究蛋白质与RNA之间的相互作用。这些相互作用对于理解细胞内的许多生物过程至关重要，包括基因表达、蛋白质合成和细胞信号传导。近年来，mRNA展示技术(mRNA Display)引起了广泛关注，它为科学家们提供了一种强大的工具来探索这些复杂的分子间关系。

什么是mRNA展示技术？

mRNA展示技术又称mRNA-蛋白质融合体展示技术，是将基因型(mRNA)与表型(多肽/蛋白)融合的体外多肽/蛋白筛选技术，将肽与其编码mRNA进行共价连接，使用嘌呤霉素作为连接物。可用于生物分子配体的发现和相互作用分析。

mRNA展示库的构建

1. DNA库制备：使用分子生物学技术制备DNA库(通常为编码约4~14个氨基酸的环肽)；
2. DNA库的体外转录：通过RNA聚合酶的作用，DNA库被转录成mRNA；
3. 嘌呤霉素连接：嘌呤霉素分子通过DNA连接子序列连接到每个mRNA上，嘌呤霉素是一种抗生素，作为氨基酰化的tRNA类似物(tRNA在翻译过程中向核糖体传递氨基酸)，并作为mRNA和肽之间的连接子；
4. mRNA库的体外翻译：mRNA-嘌呤霉素偶联物进行体外翻译，由核糖体翻译生成相应的肽；
5. 线性肽的环化修饰：通过化学合成技术进行环化修饰；
6. 逆转录：mRNA逆转录形成mRNA-cDNA双链，产生mRNA/cDNA-嘌呤霉素-肽偶联物库；
7. 孵育与洗涤：将mRNA-cDNA-肽融合库与固定在固体载体上的靶蛋白一起孵育，然后进行洗涤以去除未结合的肽；
8. 扩增、富集与测序：结合肽的cDNA通过PCR扩增，然后用作DNA库模板，在进一步的重复几轮mRNA展示库筛选中，富集与靶蛋白高亲和力的结合肽，最后通过cDNA的测序来确定多肽的结构。

图1. mRNA展示技术流程概述

技术亮点

体外筛选：整个过程均在体外进行，无需依靠细胞

通过嘌呤霉素形成mRNA-蛋白质复合物

嘌呤霉素为一种蛋白质合成抑制剂，由于具有与酪氨酰-tRNA末端相似的结构，因此能与氨基酸结合。通过寡核苷酸连接子将嘌呤霉素与mRNA的3'端连接，通过核糖体的体外翻译作用，以带有嘌呤霉素的mRNA为模板，在重组元件蛋白合成(PURE)翻译系统中翻译成新生肽链。

Puromycin is incorporated by the ribosome at the C terminus of the peptide[2]

体外遗传密码重编程技术

引入非典型氨基酸：

1. mRNA-嘌呤霉素偶联物进行体外翻译中，可以使用细胞裂解液或单独纯化的各组分的重组混合物进行，例如使用重组元件蛋白合成(PURE)翻译系统；
2. PURE翻译系统允许对翻译所需的成分进行完全控制，包括氨基酸、氨酰tRNA合成酶(aaRS)、tRNA和翻译因子，允许遗漏和/或替代各种组分。

利用重组元件蛋白合成(PURE)翻译系统：

1. 对于底物为接近天然氨基酸的类似物，可以简单地用非蛋白氨基酸替代天然氨基酸；
2. Flexible in vitro translation (FIT)的方法：利用Flexizyme催化制备携带非蛋白类氨基酸(nAA)的tRNA，并将其引入PURE系统，替代天然氨基酸及其相应的tRNA，并将相应非蛋白氨基酸结合在合适的密码子处。

mRNA展示肽库的环化修饰

基于二氨基酰戊二酸的环化：

Roberts组报道了一种采用经典的二氨基酰戊二酸连接子的方法，将肽的N端氨基与下游赖氨酸残基的侧链氨基连接，在N端和赖氨酸残基之间包含有2至10个残基的可变区域

基于二溴二甲苯的环化修饰：

Szostak组报道了一种将两个半胱氨酸残基通过间位取代的二溴二甲苯连接的环化修饰方法，生成由不可还原的硫醚键环化的大环肽库

基于羊毛硫肽的环化修饰：

Szostak组报道了另一种基于羊毛硫肽化合物(Lanthipeptides)的环化修饰：

1. Lanthipeptides是由核糖体合成并经翻译后修饰的肽，其特征是羊毛硫氨酸(lanthionine)部分的存在
2. 该方法是通过在PURE系统中采用4-硒赖氨酸取代赖氨酸，mRNA展示库首先用谷胱甘肽二硫化物处理，来保护半胱氨酸残基，然后，用过氧化氢溶液诱导4-硒赖氨酸氧化消除，生成脱氢丙氨酸残基。用TCEP还原二硫化物，引发了分子内对脱氢丙氨酸的1,4加成，而形成硫氨酸部分

基于N-氯乙酰氨基酸的环化：

HiroakiSuga组报道了一种通过体外翻译生成大环骨架的新方法：

1. 位于起始位置的N-氯乙酰氨基酸与下游半胱氨酸残基的侧链硫醇反应，形成硫醚桥，该反应在翻译步骤后自发发生，不需要额外的连接试剂。
2. 利用Flexizyme催化tRNA氨基酰化的遗传密码重编程，在体外翻译系统中安装N-氯乙酰氨基酸

双环肽环化修饰库：

HiroakiSuga组报道了两种正交环化化学(Cu催化叠氮-炔环加成和硫醚环化)方法，通过核糖体合成产生双环肽，Hartman组的一项相关研究，将双环肽修饰技术应用到了mRNA展示库中：

1. 两个半胱氨酸残基首先与间二溴二甲苯连接，然后通过Cu催化的叠氮-炔环加成，在β-叠氮高丙氨酸和对乙炔基苯基丙氨酸残基之间形成三唑环，其在体外翻译中分别替代自甲硫氨酸和苯丙氨酸
2. 通过移动一个半胱氨酸和乙炔基残基的位置，得到不同大小的双环肽库

mRNA展示技术的优势

mRNA展示技术属于体外展示技术，与包括噬菌体展示技术在内的体内展示技术相比，具有多种优势，主要体现在更大的化合物库容量、化合物多样性、筛选过程和实验周期等。

mRNA展示技术的优势：

1. 更大的化合物库容量：与噬菌体展示技术相比，mRNA展示技术使用体外转录和翻译(IVTT)，避免了对大肠杆菌转染的需要(而这限制了噬菌体展示库的大小在108个序列)，mRNA展示技术可以制备更大的化合物库(101213个序列)
2. 化合物多样性：可构建引入多种非天然氨基酸的肽库
3. 筛选过程中的反应条件：整个过程在无细胞条件下进行；可完全控制筛选的条件
4. 实验周期：筛选测序周期更短，mRNA展示技术筛选+多肽测序周期23周，而噬菌体展示需要68周。

Comparison of the most common biomolecular display technologies[3]

总之，mRNA展示技术由于其突出的优势拥有广泛的应用场景。

案例分享

2021年荷兰Leiden大学Martin教授组通过mRNA展示技术筛选并合成了多个烟酰胺 N-甲基转移酶（NNMT）非竞争性多肽抑制剂。NNMT 使用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作为甲基供体，将烟酰胺甲基化形成1-甲基烟酰胺（MNA）。NNMT是包括癌症、糖尿病和肥胖在内的多种疾病的潜在治疗靶点。

Martin组通过 mRNA 展示筛选技术筛选的几种环肽显示出对 NNMT 的有效抑制，IC50值低至229 nM。还发现这些肽在细胞测定中下调 MNA 的产生。有趣的是，底物竞争实验表明，这些环肽抑制剂与 SAM 或 NA 无关，表明它们可能是第一个报道的 NNMT 变构抑制剂。

图2. RaPID mRNA展示系统概述

总结与展望

mRNA展示技术作为一种新兴的体外筛选多肽和蛋白质的有力工具，通过mRNA与翻译出的多肽或蛋白质共价结合，形成mRNA-多肽/蛋白质融合体，能在大容量的多肽化合物库中筛选具有特定生物学功能的多肽或蛋白质。mRNA展示技术解决了噬菌体展示、酵母表面展示等展示技术面临的多数困难，有利于构建更加多样化的化合物库，有助于蛋白质体外筛选技术的进一步发展。

参考文献

[1] Catrin Sohrabi, et al. Methods for generating and screening libraries of genetically encoded cyclic peptides in drug discovery. Nat Rev Chem. 2020 Feb;4(2):90-101. doi: 10.1038/s41570-019-0159-2.

[2] Hayden Peacock, et al. Discovery of De Novo Macrocyclic Peptides by Messenger RNA Display. Trends Pharmacol Sci.2021 May;42(5):385-397. doi: 10.1016/j.tips.2021.02.004.

[3] Madhu Biyani, et al. Biomolecular Display Technology: A New Tool for Drug Discovery. Animal Biotechnology. Models in Discovery and Translation. 2014, Pages 369-384.

[4] Matthijs J van Haren, et al.Macrocyclic peptides as allosteric inhibitors of nicotinamide N-methyltransferase (NNMT). RSC Chem Biol. 2021 Aug 19;2(5):1546-1555. doi: 10.1039/d1cb00134e. eCollection 2021 Oct 7.

[5] Kristopher Josephson,et al.mRNA display: from basic principles to macrocycle drug discovery. Drug Discov Today.2014 Apr;19(4):388-99. doi: 10.1016/j.drudis.2013.10.011.

[6] Matilda S Newton, et al. In Vitro Selection of Peptides and Proteins-Advantages of mRNA Display. ACS Synth Biol. 2020 Feb 21;9(2):181-190. doi: 10.1021/acssynbio.9b00419.