Cell | 哈佛医学院ZnCPT技术揭秘人类锌结合半胱氨酸蛋白质组全景图
Cell | 哈佛医学院ZnCPT技术揭秘人类锌结合半胱氨酸蛋白质组全景图
锌是一种人体必需的微量元素，广泛参与细胞中的各种生理过程。锌结合蛋白在细胞代谢、信号传递和基因表达中具有关键作用，并与癌症、免疫紊乱和神经退行性疾病等重大疾病密切相关。然而，由于缺乏全局性的研究方法，其具体结合位点和调控机制长期未被系统解析。
围绕“细胞中的锌结合蛋白有哪些？它们如何调节细胞功能？”这一关键问题，美国Dana-Farber癌症研究所、哈佛医学院的Edward T.Chouchani团队开发了创新的ZnCPT（Zinc-Cysteine Proteome Tagging）技术，并于2024年12月26日在《Cell》上发表了题为“The Human Zinc-Binding Cysteine Proteome”的论文。该方法首次系统性描绘了人类锌结合半胱氨酸的全景图，实现了对超过58,000个半胱氨酸位点的深度定量分析，并明确鉴定了数千个具有锌结合功能的位点。
研究团队开发了一个交互式网页供访问这些宝贵的资源：https://zncpt-chouchani-lab.dfci.harvard.edu。
此外研究还揭示了锌结合的三种主要模式：
1.稳定结合（Constitutive Binding）；
2.动态诱导结合（Inducible Binding）；
3.锌与其他金属（如铁）的竞争结合。
进一步分析发现，锌结合对癌症相关蛋白（如谷胱甘肽还原酶，GSR）具有关键的活性调控作用。通过抑制GSR功能，可有效杀死依赖GSR的肺癌细胞。团队利用交叉验证的方法证明了ZnCPT技术的可靠性，并发现了许多此前未被描述的新型锌结合蛋白，为未来的疾病研究提供了丰富资源。
CPT技术深度挖掘锌结合半胱氨酸蛋白质组
研究通过ZnCPT（Zinc-Cysteine Proteome Tagging）技术首次实现了锌结合半胱氨酸蛋白质组的深度覆盖与精准定量。研究团队开发了一种结合半胱氨酸衍生化和富集方法与多重蛋白质组学的策略（CPT与TMT-multiplexed chemoproteomics），用于量化人类蛋白质组中超过58,000个半胱氨酸位点的锌结合状态。利用大规模质谱分析方法，该研究在不同细胞类型中鉴定了这些位点，其中包含6,173个锌结合位点。
研究还区分了三种锌结合模式：构成性锌结合、构成性金属结合和诱导性锌结合。特别是可诱导锌结合的特性在金属螯合剂（如TPEN）和锌补充实验中表现出显著差异。相比以往技术，ZnCPT技术展示了前所未有的覆盖深度和灵敏度，为锌结合蛋白质组学研究提供了全新工具。
（CPTs对锌结合半胱氨酸蛋白质组的覆盖和量化）
锌结合蛋白的“群像特征”
通过对超过6,000个锌结合位点的解析，研究发现大部分映射的半胱氨酸位点此前未进行锌结合的实验评估，而CPT方法使半胱氨酸肽的富集水平提高了一个数量级以上。进一步分析显示，构成性锌结合蛋白主要分布于细胞核，尤其富集于与DNA结合相关的锌指蛋白中；而诱导性锌结合蛋白则集中于内质网、溶酶体等囊泡系统，表明其与动态信号调控相关。
此外，研究揭示了锌是主要与半胱氨酸残基配位的蛋白质结合金属，并发现锌结合对蛋白质的溶剂可及性及周围环境有显著影响，表明其可能通过间接调控机制参与调节蛋白质复合体的功能。
（锌结合蛋白质组的群体特征）
ZnCPT还原并扩展锌结合蛋白的全貌
与已知数据库（如ZincBind）相比，ZnCPT在构成性锌结合方面具有一定重叠，而在诱导性锌结合方面的覆盖显现出其独特性。此外，与基于生物信息学和序列分析预测的锌结合数据集（Andreini等人、Passerini等人以及UniProt注释）相比，ZnCPT分别覆盖了约53%（TPEN数据集）和约60%（ZnCl₂数据集）的蛋白质。该技术还揭示了许多未被报道的锌结合蛋白及其结合位点。这些发现不仅验证了ZnCPT的准确性，还为探索锌结合的功能多样性提供了重要资源，拓展了锌结合蛋白质组的研究边界。
（ZnCPT与已知锌结合蛋白质组的比较）
锌结合蛋白质组的结构与序列特征
通过将蛋白质家族数据库（Pfam）域注释映射到ZnCPT，研究确定了经典的锌结合域（如C2H2型锌指域）在锌结合位点中高度富集。结合一级序列基序分析，发现锌结合位点周围±6个位置的氨基酸组成具有显著特征，尤其富含半胱氨酸和组氨酸。
在结构层面，研究利用人类AlphaFold预测的三维结构数据，对锌配位半胱氨酸的微环境进行了分析，发现构成性和诱导性锌结合位点在结构特征上既存在共同点，也展现出显著的差异性。大多数锌结合位点位于疏水性较强的蛋白质核心区域，这种环境可能有助于锌结合的稳定性，同时提示锌结合可能通过特定的蛋白质-锌相互作用模式维持三维结构并调控功能域活性。
（锌结合蛋白质组的结构和序列特征）
ZnCPT技术鉴定新型锌结合蛋白
ZnCPT技术不仅验证了已知锌结合蛋白，还识别了数千个此前未被描述的锌结合位点，显著扩展了锌结合蛋白质组的范围。通过对同源蛋白及蛋白质家族中保守锌结合位点进行研究，研究团队发现了一批新型锌结合蛋白，这些蛋白广泛分布于信号转导、代谢调控和细胞周期控制等关键通路。研究通过质谱技术确认这些新位点，并进一步结合突变实验验证了锌结合对相关蛋白功能的重要性。
（ZnCPT识别新的锌结合蛋白）
锌在金属离子代谢网络中的多维调控作用
通过比较锌结合蛋白质组和可逆氧化半胱氨酸修饰蛋白质组，研究发现锌结合与氧化还原调节存在一定交集，但高度氧化还原修饰的半胱氨酸在构成性和诱导性锌结合蛋白质组中的代表性不足。然而，一些半胱氨酸同时适合锌结合和氧化还原修饰，且两者在结构特征上存在显著差异。
此外，研究还揭示了锌在铁结合蛋白中的动态调节作用。诱导性锌结合蛋白中富集了铁结合蛋白类，共鉴定出14种铁结合蛋白作为诱导性锌结合蛋白的靶点，包括关键的铁调控蛋白EGLN1（PHD2）。这些发现揭示了锌在金属离子代谢网络中的多维调控作用，为理解锌与其他金属离子协同机制提供了全新视角。
（锌结合与氧化还原调节的半胱氨酸蛋白质组的重叠及与铁结合蛋白的相互作用）
锌如何“管控”肿瘤相关蛋白？
研究结合ZnCPT技术与大规模CRISPR筛选数据（DepMap），系统性鉴定了一组对癌细胞生存至关重要的锌结合蛋白。这些蛋白广泛分布于DNA修复、代谢调控和信号传导通路中。进一步分析表明，一些锌结合蛋白具有显著的癌症基因依赖性，是癌细胞中潜在的关键调控因子。功能研究聚焦于谷胱甘肽还原酶（GSR），发现其在肺癌细胞中表现出显著的选择性依赖性，直接参与氧化还原代谢调控。这些发现表明，通过抑制锌结合蛋白的功能，特别是那些在癌细胞中高度表达的致癌蛋白，可能为癌症治疗提供全新的靶点和策略。
（锌调节的肿瘤相关蛋白的系统功能分类）
锌结合GSR：诱导特定肺癌细胞死亡的机制
通过ZnCPT技术，研究鉴定了GSR的活性位点和二聚体界面的锌结合半胱氨酸，并发现锌结合能够直接抑制GSR的酶活性，扰乱谷胱甘肽（GSH）的氧化还原平衡。这种紊乱进一步导致氧化应激和细胞死亡，在肺癌细胞A549和SKMES1中尤为显著，而对正常细胞影响较小。
通过实验，研究确认了锌结合对GSR功能的靶向作用，并通过结构建模解析了锌抑制GSR活性的分子机制。进一步的体外和体内实验表明，锌结合对GSR依赖的肺癌细胞具有强烈的细胞毒性，显著抑制肿瘤生长。特别是，通过饮食补充锌，研究观察到GSR依赖型肿瘤的生长受到了限制。
这些发现不仅揭示了锌在癌细胞氧化还原代谢调控中的关键作用，还为基于锌调控的肺癌靶向疗法开发提供了强有力的支持。
（锌与GSR的结合及对肺癌细胞的影响）
研究结论
本文开发了一种创新的深度蛋白质组学分析方法——ZnCPT（Zinc-Cysteine Proteome Tagging），首次系统性描绘了人类锌结合半胱氨酸蛋白质组的“全景图”。研究通过结合半胱氨酸衍生化和富集方法与多重蛋白质组学，全面量化了数千个锌结合半胱氨酸位点，揭示了锌结合的三种主要模式：稳定结合、动态诱导结合以及与其他金属（如铁）的竞争结合。此外，研究定义了锌调节的结构域、酶活性和变构功能，并首次发现锌结合对多种关键生物学过程（如氧化还原代谢和铁-硫簇蛋白功能）的深远影响。
通过大规模CRISPR筛选和锌结合蛋白质组数据整合，研究系统性筛选并验证了一组与癌细胞生存密切相关的锌结合致癌蛋白，特别是谷胱甘肽还原酶（GSR）。研究发现锌结合可通过调控GSR活性，显著诱发氧化应激并导致癌细胞死亡，为肺癌治疗提供了潜在的靶点。