南林大团队Nature子刊：光热纳米纤维介导光穿孔实现胞内递送
南林大团队Nature子刊：光热纳米纤维介导光穿孔实现胞内递送
南京林业大学黄超伯/熊燃华课题组在Nature Protocols上发表最新研究成果，开发了一种基于光热静电纺纳米纤维（PEN）介导的光穿孔技术，用于生物大分子的胞内递送。该技术通过将光热纳米颗粒嵌入静电纺纳米纤维中，避免了细胞与纳米颗粒的直接接触，显著降低了安全性和监管风险。研究团队详细描述了该技术的工作原理、实验步骤、优化参数，并展示了其在细胞免疫治疗中的应用效果。
生物大分子药物的胞内递送是生物药物面临的一个关键问题。光介导的胞孔技术具有较好的通用性和调控性，适用于各类细胞和各种生物药物的递送，尤其是在体外或离体处理的情况，因此受到了越来越多的关注。
黄超伯/熊燃华课题组长期致力于功能性生物大分子胞内递送研究，提出了一种基于光热静电纺纳米纤维（PEN）介导的光穿孔技术。该技术通过将光热NPs嵌入静电纺纳米纤维中，作为细胞培养的基底，利用光热效应诱导细胞膜透化，进而有效递送生物大分子至各种细胞类型。与传统方法相比，该技术避免了细胞与NPs的直接接触，从而显著降低了安全性和监管风险。与常用的物理转染方法——电穿孔相比，PEN光穿孔对细胞的损伤更小，能够获得更高质量的工程化改造细胞，展现出更强的临床治疗潜力。
图1. PEN光穿孔用于胞内递送的详细步骤。（1）静电纺丝制备包载光热纳米颗粒的PEN纳米纤维基底。（2）PEN基底和细胞共培养。（3）PEN光穿孔激光辐射平台。（4）利用模型大分子优化PEN光穿孔参数。（5）采用优化的PEN光穿孔方案，将功能大分子递送至各种类型细胞。（6）体外和体内验证PEN光穿孔工程化改造CAR-T细胞的治疗效果。
研究人员采用荧光模型大分子（如RD10或FD10）在贴壁HeLa细胞和悬浮Jurkat细胞中进行优化。共聚焦显微镜图像的定量分析表明，更高的激光能量或光热NPs浓度确实能够增强细胞膜的通透性，从而更容易让大分子进入细胞，提高递送效率，但也会逐渐降低细胞活性。平衡递送效率和细胞活性对于大分子胞内递送至关重要。当激光能量为0.08 J cm?2，光热NPs浓度为1 wt%时，HeLa细胞的最佳递送效率约为76%。对于Jurkat悬浮细胞，共聚焦z堆叠图像显示，细胞在聚丙烯胺盐酸盐（PAH）涂层的PEN上附着更好。当激光能量为0.16 J cm?2，光热NPs浓度为2 wt%（每个细胞接触约12个光热NPs纳米簇）时，获得了约63%的最佳递送效率。
图2. PEN 光穿孔参数优化用于 HeLa贴壁细胞和 Jurkat 悬浮细胞的递送。（a）在有和无胶原涂层的 PEN 基底上生长的 Calcein AM 标记的 HeLa 细胞的共聚焦图像。（b）HeLa 细胞在不同激光能量和光热NPs 浓度下的 RD10递送效率和细胞活性。（c）深红色荧光 CellMask 标记的 Jurkat 细胞在香豆素6标记的 PEN基底上的共聚焦图像。（d）Jurkat 细胞在不同激光能量、光热NPs 浓度、和重复激光照射下的FD10递送效率和细胞活性。
成功实现模型大分子胞内递送后，光热纳米纤维进一步被应用于生物功能大分子siRNA和CRISPR/Cas9的胞内递送。首先，使用优化的PEN光穿孔参数（1 wt%光热NPs浓度，0.08 J cm?2激光能量，胶原蛋白涂层的PEN）可将抗绿色荧光蛋白（GFP）的siRNA（siGFP）递送到稳定表达GFP的H1299细胞中。共聚焦图像显示随着siGFP浓度的增加，在PEN光穿孔成功下调了eGFP表达。通过流式细胞术量化的MFI表明，在0.5μM低浓度的siGFP下，重复进行4次PEN光穿孔与进行1次5 μM浓度的PEN光穿孔所获得的下调效果相同。此外，共聚焦图像和流式细胞术分析表明，H1299细胞的eGFP表达可以通过PEN光穿孔递送CRISPR–Cas9 RNPs进行有效敲除。通过提高RNP浓度并重复进行4次PEN光穿孔，eGFP敲除效率达到了80%。
图3. PEN 光穿孔应用于功能大分子siRNA或CRISPR-Cas9 RNPs的胞内递送研究。（a）共聚焦显微镜显示了使用 1 wt% 光热NPs 和 0.08 J cm?2 激光能量进行 PEN 光穿孔处理的对照组和 siGFP胞内递送的 H1299 细胞eGFP 的表达。（b,c）不同 siGFP 浓度或在低浓度 0.5 μM siGFP下重复 PEN 光孔化处理时，H1299 细胞eGFP 表达的 MFI 和 eGFP 敲低效率。（d）共聚焦显微镜显示了光穿孔将CRISPR-Cas9 RNPs递送到H1299细胞以敲除GFP表达。（e,f）不同 RNP 浓度或在低浓度 0.5 μM RNP下重复 PEN 光孔化处理时，H1299 细胞eGFP 表达的 MFI 和 eGFP 敲除效率。
最后，PEN光穿孔被应用于人供体来源的T细胞的siRNA胞内递送。优化的PEN光穿孔参数（5 wt% 光热NPs浓度，0.16 J cm?2激光能量，3次激光扫描次数，NaOH水解的PEN）可用于递送抗PD-1蛋白表达的siRNA（siPD1）至人类原代T细胞，从而下调PD1表达。当siPD1浓度增加到4 μM时，PEN光穿孔T细胞中的PD1敲除效率达到80%。SKOV3肿瘤小鼠模型评估发现，在注射后第21天，PEN光穿孔的CAR T细胞携带siPD1显著减少了肿瘤大小，并且优于单独使用未功能化CAR T细胞的效果。总之，体内外实验均显示T细胞功能的提升，表明PEN光穿孔在治疗肿瘤方面具有巨大潜力。
图4. PEN光穿孔用于人T细胞高效安全的生物大分子胞内递送及其肿瘤细胞杀伤功能。（a）PEN光穿孔方法递送小干扰核酸siPD1到T细胞以抑制PD1蛋白表达。（b）使用优化的 PEN 光孔化参数（5 wt% 光热NP浓度，0.16 J cm?2 激光能量和 NaOH 水解的 PENs）时，siPD1 浓度变化对人类 T 细胞中 PD1 敲低效率的影响。（c）静脉注射CAR-T细胞(阴性对照)、PEN光穿孔处理的CAR T 细胞（携带 siPD1，实验组）和与PD1 抗体联合使用的 CAR T 细胞（阳性对照）的肿瘤大小随时间变化。
该研究为生物大分子的胞内递送提供了一种新的技术手段，具有重要的科学价值和应用前景。相关成果发表在Nature Protocols上，论文链接：https://doi.org/10.1038/s41596-024-01115-7