高通量3D结构光超分辨荧光成像技术新突破
高通量3D结构光超分辨荧光成像技术新突破
3D结构光照明显微镜因重建速度较慢和离焦背景较强，难以满足快速运动活细胞和深层散射组织的观测需求。本文面向高通量、高深度的应用需求，显著提升3D结构光的重建速度与抗散射能力，为下一代活细胞与组织超分辨成像技术奠定基础。
高通量3D超分辨荧光成像技术能够解析数百至数千个亚细胞结构、细胞器与生物组织的多维信息，在精准医疗、复杂生物过程研究和大规模细胞筛选中具有重要应用价值。然而，目前的3D超分辨成像技术难以实现在分辨率、成像通量和重建速度之间良好平衡。本研究基于3D结构光显微成像（3DSIM）技术，结合空间域重建和光学层切技术，成功开发出一种速度更快、质量更高的3DSIM成像方案，为科学家提供了高效、精确观测活细胞及组织3D高分辨信息的新工具。
图1 图文摘要
结构光照明显微成像技术（SIM）由于其超高分辨率、低光毒性、高速成像速度的优势，成为人们观察微观生命活动的有力手段之一。结构光照明显微成像主要分为2D结构光照明显微成像（2DSIM）与3D结构光照明显微成像（3DSIM）。与2DSIM相比，3DSIM将轴向分辨率也提升至衍射极限的两倍，实现3D超分辨成像的能力，更有助于观察细胞与组织的三维变化；和2DSIM相同的是，3DSIM同样需要算法重构求解超分辨结果。
由于SIM的重建速度一般远低于硬件采集速度，西安交通大学雷铭教授课题组提出了2DSIM以及单层3DSIM的空域-频域联合重建方案实现了JSFR-SIM的实时重建。然而多层3DSIM需要轴向样本扫描，其数据通量相对于单层SIM高出12个数量级，重建时间高出23个数量级。这就要求科研人员需要采用先成像、再重建的成像策略，往往造成精细结构的忽略和无法实现实验的实时反馈。同时极高的数据通量会对运行内存和计算资源提出较高的要求（图2a）。此外，3DSIM面向组织或厚细胞样本成像的过程中，离焦背景往往会对图像重建造成极大的影响，现有基于陷波的重建算法会造成离焦重构伪影，而基于染料与层选照明的方法又会引起光毒性的增加。最后，由于传统频域重建中频域滤波器的设计需求，原始数据的采集层数通常需要大于等于6层才能实现重建，造成单层2DSIM与6层3DSIM之间的应用空白，不适用离焦背景较强的薄样本成像。
图2（a）以1024×1024×22像素点的三维图像为例，三维结构光照明成像流程与所需时间对比。（b）不同大小图像重构所需时间与不同重建技术对比。其中Open表示传统频域重构方法，FO表示本文提出的空域重构方法
北京大学席鹏教授课题组继2023年提出了开源、高保真3DSIM重建平台Open-3DSIM与超快、自偏振的3DSIM光路系统DMD-3DSIM后，面向高通量、强散射、低光毒性 的应用需求，再次提出了快速、光层切的三维结构光照明显微成像技术（FO-3DSIM）。FO-3DSIM继承了JSFR-SIM的空域重建思维与Open-3DSIM的频域滤波手段，将复杂的3D傅里叶变换与频谱搬移过程转化为图像的直接计算。同时利用GPU与CPU联合运算将重建所需时间降低最高八百余倍，将所需的计算内存降低4倍左右（图2b）。同时，FO-3DSIM利用结构光原始图像的条纹信息，利用三个方向的条纹图像与叠加宽场图像计算平均光学层切图像以替代宽场的零频信息，使得无需零频滤波与硬件/染料改进的情况下即可得到光学层切的重建效果，极大地提高了深层样本的重建表现。
图3（a）FO-3DSIM仅需13min即可重建亚毫米级平面、微米级深度的视野。（b）FO-3DSIM在强散射厚样本成像时优于传统重建。（c）3层3DSIM与7层3DSIM的光漂白曲线。比例尺：20 μm.
为了验证FO-3DSIM高通量大视野3D快速成像能力，本文首先对小鼠肾切片中的肌动蛋白进行组织成像，FO-3DSIM利用100倍物镜获得两倍三维分辨率提高的同时，仅需13min即可重建4530 μm × 4530 μm × 2.75 μm视野、需23分钟采集的高通量三维数据，而传统重建方法需要19.2小时（图3a）。随后，通过与光学层切技术的结合，FO-3DSIM极大地抑制了重建过程中的旁瓣伪影，实现黑藻样本结构信息的连续高保真重构（图3b）。最后，频陷波的摒弃使得FO-3DSIM的频域滤波器得到优化，实现了6层以下的多层3DSIM重构，拓宽了3DSIM在强背景、3D变化迅速的薄样本成像（如近核内质网）中的应用，在保持轴向分辨率的提高两倍的同时极大降低了光毒性与光漂白（图3c）。
总结与展望
FO-3DSIM面向3D超分辨成像高通量、近实时的应用需求，在少层、强散射条件下实现了高速、高质量的3DSIM重建，拓展了3DSIM的应用场景，并降低了时间和运行成本。本研究有望与先进硬件系统结合，进一步通过软硬件耦合优化实现实时三维超分辨成像与重构，为下一代活细胞与组织高内涵成像提供一种强大的研究工具。
本文原文来自The Innovation