一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用

一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用

本发明涉及发酵工程，尤其是一种多巴胺生产菌株及其构建方法与应用。

背景技术

1. 多巴胺（dopamine）是内源性含氮有机化合物，简称DA，是儿茶酚胺类的一种，分子式为C8H11NO2，为酪氨酸（芳香族氨基酸）在代谢过程中产生的中间产物。多巴胺系统调节障碍则会导致帕金森病、精神分裂症、注意力缺陷多动综合征和垂体肿瘤等疾病的发生，此外，多巴胺还常被用于治疗多种类型的休克病症。

2. 不仅如此，以多巴胺为原料，还可生产如羟基酪醇、红景天苷等高附加值产品，具有非常良好的市场前景。

3. 目前多巴胺的合成方法还是主要集中在化学合成法，如用胡椒乙胺一步水解，或者使用香兰素进行一系列化学反应合成多巴胺。但是由于化学合成法反应复杂，成本高昂且部分原料具有毒性，目前急需一种更加绿色、安全、廉价的多巴胺合成方法。

技术实现思路

1. 本发明所要解决的技术问题在于提供一种多巴胺生产菌株。

2. 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述多巴胺生产菌株的构建方法。

3. 本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述多巴胺生产菌株的应用。

4. 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

5. 一种质粒，为质粒PET-DA02，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示。

6. 优选的，上述质粒，携带复制起始位点、卡那霉素抗性基因、TRC启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于Drosophila melanogaster的DMDDC基因。

7. 一种多巴胺生产菌株，为多巴胺基因工程菌DA-14，是在 E. coli W3110的基础上进行代谢工程改造获得的，缺失了Tyna、Tyrr、Pykf基因，上调了Arogfbr、Aroe、Tyrafbr、Tyrb、Arop、Pdxj、Pdxh基因，异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum 的CG0898基因以及Serratia rubidaea的HPABC基因，同时携带了上述质粒PET-DA02，所述质粒PET-DA02异源表达了来源于Drosophila melanogaster的DMDDC基因。

8. 优选的，上述多巴胺生产菌株，以 E. coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的Tyna、Tyrr、Pykf基因；利用TRC启动子强化来源于Arogfbr基因转录，并整合到基因组YGAY基因位点；利用TRC启动子强化Aroe基因转录强度，并整合到基因组YCGH基因位点；利用TRC启动子强化Tyrafbr基因转录强度，并整合到基因组YEEP基因位点；利用TRC启动子强化Tyrb基因转录强度，并整合到基因组YEEL基因位点；利用TRC启动子强化Arop基因转录强度，并整合到基因组YJIP基因位点；利用TRC启动子强化Pdxj基因转录强度，并整合到基因组RPH基因位点；利用TRC启动子强化Pdxh基因转录强度，并整合到基因组YCiq基因位点；利用TRC启动子强化CG0898基因转录强度，并整合到基因组YJGX基因位点；利用TRC启动子强化HPABC基因转录强度，并整合到基因组YLBE基因位点；利用TRC启动子强化HPABC基因转录强度，并整合到基因组YCDN基因位点。

9. 优选的，上述多巴胺生产菌株，是在 E. coli W3110的基础上进行代谢工程改造获得的，具体为：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，在基因组上敲除伯胺氧化酶Tyna；在基因组上敲除转录调节因子基因Tyrr；在基因组上敲除丙酮酸激酶基因Pykf；在基因组YGAY位点上整合Dahp合成酶基因Arogfbr；在基因组YCGH位点整合莽草酸脱氢酶基因Aroe；在基因组YEep位点上整合预苯酸脱氢酶基因Tyrafbr；在基因组YEEL位点上整合芳香族氨基转移酶基因Tyrb；在基因组YJIP位点上整合芳香族氨基酸转运蛋白基因Arop；在基因组RPH位点上整合吡哆醇-5-磷酸合酶基因Pdxj；在基因组YCiq位点上整合吡哆醇 5'-磷酸氧化酶基因Pdxh；在基因组YJGX位点上整合吡哆醛 5'-磷酸合酶基因CG0898；在基因组YLBE位点上整合4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因HPABC；在基因组YCDN位点上整合4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因HPABC，对其进行双拷贝表达；在PET-28A(+)质粒的基础上敲除其上的Laci基因构建PET-DA01质粒，在PET-DA01质粒的基础导入来源于果蝇的多巴脱羧酶基因DMDDC构建PET-DA02质粒。

10. 优选的，上述多巴胺生产菌株，所述 E. coliW3110为 E. coliW3110 ATCC 27325。

11. 优选的，上述多巴胺生产菌株，所述TRC启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示； Tyna基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；Tyrr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示；Pykf基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示；Arogfbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示；Aroe基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示；Tyrafbr基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示；Tyrb基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示；Arop基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示；Pdxj基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示；Pdxh基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示；CG0898基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示；HPABC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示。

12. 优选的，上述多巴胺生产菌株，所述质粒PET-DA02携带的终止子（Terminator）的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；Laci基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示；DMDDC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示；质粒PET-DA01的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.17所示；质粒PET-DA02的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.18所示。

13. 上述多巴胺生产菌株的构建方法，在出发菌株E. coliW3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：

14. (1)底盘菌改造：以E. coli W3110为出发菌株，敲除了Tyna、Tyrr、Pykf基因，上调了Arogfbr、Aroe、Tyrafbr、Tyrb、Arop基因，异源表达了来源于Serratia rubidaea的HPABC基因；

15. （2）优化辅因子供给系统：因为多巴脱羧酶具有PLP依赖性，因此加强了Pdxj和Pdxh基因并异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum的CG0898基因，提高了PLP的合成量，为多巴脱羧酶的表达提供充足的辅因子；

16. （3）PET-DA02质粒系统：质粒PET-DA02携带复制起始位点、卡那霉素抗性、TRC启动子、终止子等质粒元件，以该质粒PET-DA02高效表达了来源于Drosophila melanogaster的DMDDC基因，基因选用TRC启动子强化转录。

17. 上述多巴胺生产菌株在发酵生产多巴胺方面的应用。

18. 优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，在培养基中进行发酵培养，培养基包括但不限于碳源、氮源、无机盐、维生素等；发酵条件包括发酵温度、发酵PH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。

19. 优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，具体步骤如下：

20. ①斜面培养：取多巴胺生产菌株接种在斜面培养基上，32℃培养12-16h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；

21. ②种子培养：使用机械搅拌式发酵罐，培养温度为37℃，通过自动流加氨水溶液维持培养PH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当OD600nm为15时达到接种要求；

22. ③发酵培养：使用机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，培养温度为37℃，通过自动流加氨水溶液维持培养PH在7.0±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/L，发酵周期为48 h。

23. 优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，所述种子培养中采用的种子培养基为：葡萄糖20 g/L，酵母3 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO41 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，柠檬酸1.5 g/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸0.5 g/L，FeSO4·7H2O 10 mg/L，MgSO4·7H2O 10mg/L，其余为水。

24. 优选的，上述多巴胺生产菌株的应用，所述发酵培养中采用的发酵培养基为：酵母粉3.5 g/L，蛋白胨1 g/L，(NH4)2SO42 g/L，K2HPO4·3H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 2 g/L，谷氨酸2 g/L，蛋氨酸0.5 g/L，柠檬酸3g/L，MnSO4·7H2O 10 mg/L，FeSO4·7H2O 30 mg/L，其余为水。

25. 上述培养基均可采用标准方法制备获得。

26. 有益效果：

27. 上述多巴胺生产菌株，缺失了Tyna、Tyrr、Pykf基因，上调了Arogfbr、Aroe、Tyrafbr、Tyrb、Arop、Pdxj、Pdxh基因，异源表达了来源于Corynebacterium glutamicum 的CG0898基因、 Serratia rubidaea的HPABC基因。同时所述生产菌携带了质粒PET-DA02，所述质粒异源表达了来源于Drosophila melanogaster的DMDDC基因；所述菌株通过优化辅因子供给系统，为关键酶多巴脱羧酶的表达提供了充足的辅因子，提高多巴胺生产水平，实现了多巴胺的高效生产，具有优秀的工业应用前景。具体来说：

28. （1）通过敲除了多Tyna基因，减少多巴胺的分解；（2）通过加强Arop基因，使目的产物多巴胺更容易外排；（3）通过加强Pdxj、Pdxh，异源引入CG0898基因，提高了PLP的合成量，在工程菌内部为多巴脱羧酶的表达提供了充足的辅因子，不需要外源添加PLP；（4）因为PET-28A(+)质粒上具有Laci基因，因此需要外源添加IPTG才能使其正常表达，考虑到IPTG对菌体生长具有毒性，因此敲除了Laci基因，使质粒在菌体生长过程中无需添加IPTG也可正常表达。

29. 上述多巴胺生产菌株的定向改造方法，通过多巴胺代谢合成途径改造得到的工程菌DA-14采用从头合成的方法，以葡萄糖为碳源，无需添加酪氨酸底物，生产成本低，具有生产速率高，合成效率高，发酵周期短，菌株稳定性高的优点，发酵罐发酵方法生产多巴胺，发酵48h生产多巴胺39.28g/L，大大提高了多巴胺的生产水平，具有很高的经济效益，为实现多巴胺的大规模生产奠定基础，具有良好的工业化前景。