紫外分光光度计操作步骤、常见问题和解决措施

紫外分光光度计操作步骤、常见问题和解决措施

紫外分光光度计是一种广泛应用于生物、医学等多个科学研究领域的精密仪器。本文将详细介绍其工作原理、结构组成、操作步骤以及常见问题的解决方法，帮助读者更好地理解和使用这一重要实验工具。

紫外分光光度计

紫外分光光度计是广泛应用于生物、医学等多个科学研究领域的仪器之一。紫外分光光度计仪器分析法是利用物质分子吸收紫外可见光谱区辐射的一种仪器分析方法。其基本原理依据朗伯·比尔定律——光被透明介质吸收的比例与入射光的强度无关，光的吸收与吸收层厚度、溶液浓度、光吸收率成正比，可用下式表示：

A=k×b×c

（A为吸光度；k为摩尔吸光系数；b为光程，即盛放溶液的液槽的透光厚度；c为溶液浓度。）

仪器结构

紫外分光光度计由光源、单色器、吸收池、检测器和信号显示系统五大部分组成。

• 光源：是提供符合要求的入射光的装置，有热辐射光源和气体放电光源两类。热辐射光源用于可见光区，一般为钨灯和卤钨灯，波长范围是350nm～1000nm；气体放电光源用于紫外光区，一般为氢灯和氘灯，连续波长范围是180nm～360nm。
• 单色器：功能是将光源产生的复合光分解为单色光和分出所需的单色光束，它是分光光度计的心脏部分。
• 吸收池：又称比色皿，供盛放试液进行吸光度测量之用，其底及两侧为毛玻璃，另两面为光学透光面，为减少光的反射损失，吸收池的光学面必须完全垂直于光束方向。根据材质可分为玻璃池和石英池两种，前者用于可见光光区测定，后者用于紫外光区。
• 检测器：是将光信号转变为电信号的装置，测量吸光度时，并非直接测量透过吸收池的光强度，而是将光强度转换为电流信号进行测试，这种光电转换器件称为检测器。
• 信号显示系统：是将检测器输出的信号放大，并显示出来的装置。

优势与局限性

优势

• 可重复使用样品
• 可以快速进行测量
• 仪器使用操作简单
• 数据分析操作简单
• 产品成本、操作成本低

局限性

• 杂散光：波长选择器并不完美，来自宽波长范围的少量光仍可能从光源传输，这可能会导致严重的测量错误。
• 光散射：这通常是由液体样品中的悬浮固体引起的，这可能会导致严重的测量误差。比色皿或样品中存在的气泡会散射光，导致无法重现结果。
• 来自多个吸收物种的干扰：为了进行适当的定量分析，应将每种化学物质从样品中分离出来并单独检查。
• 组件的偏差：任何仪器组件未对准定位，尤其是固定样品的比色皿，都可能产生不可重复和不准确的结果。

操作步骤

1. 开机预热：在仪器测试之前一定要进行预热，预热的时间应该大于20min。检查样品室中是否有遮光物，有则取出。
2. 光源选择：电源打开后，钨灯会亮起。若在波长200nm～290nm之间工作，则光源切换至氘灯；在波长290nm～360nm之间工作，则要同时点亮氘灯和钨灯。
3. 波长选择：输入所需波长。
4. 设备校准：没有开机自动校准功能的设备需按说明书手动校准。
5. 开始测量：按START键开始测量，通常使用装有蒸馏水的吸收池调零后放入样品和参比样进行测试，并记录测试结果。测定前要经过预实验确定合适的样品浓度，让反应后的待测溶液的光吸收值位于0.3～0.7之间。否则，待测数据不能正确反映实际变化。如果不同样品之间浓度差异较大，则在测定时应先测定低浓度样品（浅色），再定测高浓度样品（深色）。
6. 数据处理：定量测试时通常需要先测定若干个已知浓度的待测物标准样品，根据其吸光值与浓度绘制标准曲线。
7. 关机：测量完毕后取出吸收池，清洗并晾干后入盒保存。关闭电源，拔下电源插头，在样品室内放入干燥剂，盖上样品室盖，罩上防尘罩。

常见问题与解决措施

1. 问题1：接通电源后，光源不亮

• 原因：①保险管烧坏；②光源灯泡损坏。
• 措施：①更换保险管；②检查氘灯和钨灯是否损坏，若损坏则及时更换灯泡。

2. 问题2：吸光值出现负数

• 原因：没做空白对照，样品吸光值小于空白参比液。
• 措施：先做空白对照。

3. 问题3：基线某段噪音很高

• 原因：滤光片受潮发霉，导致光能量损失严重。
• 措施：更换滤光片。

4. 问题4：吸光值信号上下摆动

• 原因：开关触点因长期氧化导致接触不良。
• 措施：用金属活化剂清洗按键触点。

5. 问题5：数字显示不能归零，同时图线记录基线位置偏高

• 原因：①信号处理板可能发生故障；②光电倍增管等老化，性能降低；③前置放大板出现故障，引起反馈量增大。
• 措施：①开机通电，先做记录故障曲线，与原始记录的标准曲线对照，找出异同点，并做定性定能分析。然后用一只同型号规格的新光电倍增管替换机上的光电管，再开机实验，若结果记录出来的图线并没有什么变化，则证明光电倍增管没有老化变质。②进一步检查信号处理板各元器件是否损坏，对影响灵敏度有关的电位器进行检测，看数据是否正常。若都正常则说明信号处理板没有故障。③对以上部件检查都没有问题，那么故障很可能发生在前置级放大板。应采用模拟测试对前置放大板进行测量，先利用直流稳压电源，把各供电电源加上，使其电路单独工作，把信号发生器发出的信号加到输入端，再用示波器接在输出端测量输出信号。将输入信号与输出信号对比，若结果波形相同，说明电路没有故障。用相同方法对另一个带驱动器的开关管进行测量，输入端加入信号后，示波器若没有测出输出端信号，则判断开关管是损坏的，应换上同一型号规格的新开关管。

实验注意事项

• 开机前将样品室内的干燥剂取出，仪器自检过程中禁止打开样品室盖。
• 比色皿内溶液以皿高的2/3～4/5为宜，不可过满以防液体溢出腐蚀仪器。
• 测定时应保持比色皿清洁，池壁上液滴应用擦镜纸擦干，切勿用手捏透光面。
• 测定紫外波长时，需选用石英比色皿。
• 测定时，禁止将试剂或液体物质放在仪器的表面上，如有溶液溢出或其它原因将样品槽弄脏，要尽可能及时清理干净。
• 实验结束后将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净，倒立晾干。关掉电源，再将干燥剂放入样品室内，并盖上防尘罩，做好使用登记。

实验小百科

紫外分光光度计的发展历史可追溯到几百年前。1852年，Beer参考了Bouguer在1729年和Lambert在1760年所发表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液层厚度相等时，颜色的强度与呈色溶液的浓度成比例，从而奠定了分光光度法的理论基础，这就是著名的朗伯·比尔定律。1854年，Duboscq和Nessler等人将朗伯·比尔定律应用于定量分析化学领域，并且设计了第一台比色计。1918年，美国国家标准局制成了第一台紫外分光光度计。此后，紫外分光光度计经过不断的改进，又出现自动记录、自动打印、数字显示等各种新的功能。这使得分光光度法的灵敏度和准确度不断提高，应用范围不断扩大。