动物行为学实验之Morris 水迷宫

动物行为学实验之Morris 水迷宫

“水迷宫”是由 Richard Morris 在1984年发明的，随后他阐述了评估学习记忆方法的细节和步骤。近30年来，在行为神经科学研究中，它成为最常用的验室研究工具之一。水迷宫实验常被用于啮齿类动物神经认知疾病模型的验证和神经认知治疗可行性的评估。有相当多的试验者利用水迷宫来评价动物的学习与记忆能力，同时也利用该实验评价水迷宫成绩、神经质系统、药物作用之间的关系。被广泛应用于学习记忆、老年痴呆、海马/外海马、智力与衰老等多个学科的科学研究，水迷宫实验在当代神经科学研究中占据了一个十分重要的位置。

图1水迷宫示意图

实验原理

通过观察并记录动物学会在水箱内游泳并找到藏在水下逃避平台所需的时间、采用的策略和它们的游泳轨迹，分析和推断动物的学习、记忆和空间认知等方面的能力。它能比较客观地衡量动物空间记忆(spatial memory)，工作记忆(working memory)以及空间辨别能力(spatial discriminability)的改变。

水迷宫系统

系统由水迷宫水池、摄像系统以及动物行为轨迹分析软件组成。水池按东南西北四个方向将水池平 均划分为4个象限（E、S、W、N），象限池壁圆弧中点为可选的动物入水点，平台可置于任意一个象限的中央。水池：宽为 90cm，高为 50cm，其中水深为 20cm，留出 30cm 的边缘用于放置提示方位的标志物（Cue）。

图 2 水迷宫尺寸示意图

水迷宫实验的两大要素：驱动力和考核内容。水迷宫的驱动力是小鼠本能对水环境的厌恶，这就驱使小鼠想要尽快逃离这个环境，其中略低于水面的平台就可以让小鼠基 本达成逃离水环境的目标。因此小鼠有动力尽快找到这个平台；而考核内容则是分析小鼠是不是能够尽快学会用周围的提示物（Cues）为线索找到水下平台。

实验流程

绝大部分水迷宫实验主要包括（但不限于）以下三个部分：

1. 平台可见期实验（“体检”期）：1-2 days
2. 平台隐藏期训练：4-5 days
3. 无平台期检测：1 day

平台可见期实验（“体检”期）

1. 根据实验要求搭建水迷宫实验设施，调整水位低于平台1cm 左右，并在水池内部粘贴方位提示物。
2. 将水池分为四个象限，分别用 N，S，W，E命名，此外再设定8个放小鼠下水的方位，从9点钟的1号位置开始逆时针到10点钟位置的8号位。
3. 每天每只小鼠进行4次实验，前两次和后两次平台分别放在相同的位置，如图3所示，放小鼠的位置在平台所在象限对面象限的两侧位置，例如平台如果在N位置，放置小鼠的位置就在2和4、放置小鼠时小鼠面朝水池壁，下水轻柔，不要让小鼠呛水（这个步骤无论是在平台隐藏期还是训练期都是一样的）；
4. 小鼠在水中自由探索1分钟，超过1分钟未找到平台，则引导小鼠到平台并让小鼠在平台上停留15s（这个步骤在平台隐藏期是一样的）；
5. 将小鼠擦干，防止热量损失过多，有条件的话擦干后的小鼠放在31-33 度左右的鼠笼中进行“烘烤”一分钟左右再放入临时笼中（不要放入长期饲养用的笼子里）；
6. 清理水池表面的粪便（可以连续2-4只小鼠实验后清理，在水迷宫实验中少量粪便影响不大）。
7. 每只小鼠两次下水的时间间隔不少于20min（因为涉及更换平台方位，所以每次都将所有实验用的小鼠完成试验后再开始下一轮比较好）。
8. 平台可见的实验有时1天以内就可以检测到小鼠运动和视力是否有明显问题，所以根据实验情况，有时也只需要一天时间。

平台隐藏期实验（训练期）

1. 根据实验要求搭建水迷宫实验设施，调整水位高于平台表面将近 1cm，并在水池内部粘贴方位提示物，使平台高度低于水平面 0.5cm-1cm 左右，在所有隐藏平台期内的平台位置固定，一般将平台的位置设定为E。
2. 将小鼠面朝水池壁轻轻放入水中。每天针对每只小鼠的四次实验，小鼠都是从 2，3， 8，7 这几个位置随机放入（其实是伪随机，每天四个位置都要用到，只是顺序可以随机）。
3. 每天每只小鼠进行4次实验，前两次和后两次平台分别放在两个不同的位置，如图3所示，放小鼠的位置在平台所在象限对面象限的两侧位置，例如平台如果在N位置，放置小鼠的位置就在2和4；
4. 放置小鼠时小鼠面朝水池壁，下水轻柔，不要让小鼠呛水（这个步骤无论是在平台隐藏期还是训练期都是一样的）；
5. 小鼠在水中自由探索1分钟，超过1分钟未找到平台，则引导小鼠到平台并让小鼠在平台上停留15s（这个步骤在平台隐藏期是一样的）；
6. 将小鼠擦干，防止热量损失过多，有条件的话擦干后的小鼠放在31-33 度左右的鼠笼中进行“烘烤”一分钟左右再放入临时笼中（不要放入长期饲养用的笼子里）；
7. 清理水池表面的粪便（可以连续 2-4 只小鼠实验后清理，在水迷宫实验中少量粪便影响不大）。
8. 每只小鼠两次下水的时间间隔不少于20min（因为涉及更换平台方位，所以每次都将所有实验用的小鼠完成试验后再开始下一轮比较好）。
9. 记录全部过程影像资料以便后续分析。

无平台探索期实验（测试期）

平台隐藏期实验完成后一段时间（具体时间间隔根据实验目的决定），撤去平台，将小鼠从1号位放入（平台隐藏期一直没有用到的离目标平台最远的位置），记录小鼠运动过程以便后续分析。

检测指标

可见平台期实验中需要统计的数据包括：

1. 从放小鼠入水到小鼠爬上平台所需时间（较重要，这个主要是检测动物的运动能力）。
2. 从放小鼠入水到小鼠爬上平台的路径长度（较重要，检测动物寻找平台的策略，特别是检测老年小鼠是否视力有问题）。
3. 小鼠游泳的游泳速度（重要，由前面两个数据相除得到）。

需要关注的行为（用于排除部分无用小鼠数据）：

• 小鼠漂浮不动的时间和次数
• 小鼠是否会爬上平台后跳下来
• 小鼠是否围绕水池边缘游泳并试图攀爬

图5 水迷宫实验“三件套”

隐藏平台实验中需要统计的数据包括：

1. 从放小鼠入水到小鼠爬上平台所需时间（最重要，最核心的数据，因为有分组和时间两个维度）。
2. 从放小鼠入水到小鼠爬上平台的路径长度（同样也是动物的搜索策略问题）。
3. 小鼠游泳的游泳速度（同可见平台期）。
4. 在整个过程中小鼠与平台中心的距离之和（另一种判断学习能力的方法，比较少见）。
5. 小鼠刚入水后的第一次向中心游动时的方向与起点-平台直线的夹角（这个就更少了）。

根据文献报道，水迷宫平台隐藏期的寻找平台的所需时间、路径长度以及与平台的距离三者之间是高度相关的。而首次游动方向则与前三者相关性较弱，因此一般我们在文章中最多只需要列出前三个数据就可以说明问题了。

无平台探索期实验中所需统计的数据：

1. 小鼠在每个象限停留的时间
2. 小鼠在每个象限的路径长度
3. 小鼠与原平台位置的平均距离
4. 小鼠第一次到达原平台位置的时间和路径长度
5. 小鼠穿过原平台位置的次数

结果分析

注意事项

1. 实验环境要求安静，保证隔音，环境噪声控制在60dB以下。
2. 实验环境需要弱光照明，照明度控制在100Lux以下。
3. 有条件的话小鼠应该在正式实验前1周移入水迷宫实验房间进行饲养。如果没有这样的条件，也应该尽量将小鼠至少连续三天每天移入水迷宫房间2-4小时，适应实验环境。
4. 实验前需要固定操作者对实验动物每天抚摸1～2min，连续5天以上，以减少非特异性应激刺激对实验动物检测中的影响。
5. 实验动物的性别、周龄尽量保持一致，因为激素水平可能会影响动物行为。
6. 注意实验动物的昼夜节律，尽量选择同一时间段开展实验，一般为每天正常光周期的开灯后1小时开始检测。
7. 水迷宫实验“三件套”：金鱼网、玻璃棒、吹风机。金鱼网用于快速捞起动物，玻 璃棒用于引导动物找到平台，吹风机用于快速蒸发水分，防止动物感冒。
8. 注意水温控制在22℃，保持相对恒温，低于20℃要及时加热。
9. 为了适应动物的趋暗性，实验室挂窗帘严密避光且整个水池周围挂遮光布帘，保证其内部无灯光直射。实验期间打开水池外的白炽灯，功率≤13 瓦，灯光直射墙面，使墙面反光分散的分布于水池内。