水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法详解

水稻超氧化物歧化酶(SOD)活性测定方法详解

水稻超氧化物歧化酶（SOD）是植物体内重要的抗氧化酶，能够清除超氧阴离子自由基，保护植物免受氧化损伤。本文将详细介绍水稻SOD活性的测定方法，包括实验原理、所需试剂、具体步骤及结果计算，为相关研究提供参考。

实验原理

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）是一种清除超氧阴离子自由基的酶。在逆境环境下，植物体内会积累超氧阴离子自由基，从而诱导SOD的产生。本实验通过检测SOD抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。具体来说，在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基。这些自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收峰。而SOD能够清除超氧阴离子自由基，从而抑制甲腙的形成。因此，反应液蓝色越深，说明酶活性越低；反之，酶活性越高。

实验试剂

1. Na2HPO4
2. NaH2PO4
3. 甲硫氨酸（Met）
4. EDTA-Na2
5. 氮蓝四唑（NBT）
6. 0.05 mol/L 磷酸缓冲液
7. 130 mmol/L 甲硫氨酸（Met）溶液
8. 750 µmol/L 氮蓝四唑溶液
9. 100 µmol/L EDTA-Na2溶液
10. 20 µmol/L 核黄素溶液

实验步骤

1. 水稻组织样品准备：到温室或田间取样，立即放置于样品袋中，存放于冰盒中带回。

2. 酶液提取

• 在天平上迅速称取水稻组织0.3-0.5 g，剪刀剪碎到预冷的研钵中。
• 加1 ml预冷的磷酸缓冲液，在冰浴上研磨成浆，研磨过程中补加缓冲液使终体积为4 ml。
• 将研磨液倒于10 ml离心管中，4 °C 5,000x g离心10 min。上清液即为SOD粗提液。

3. 显色反应

• 取2 ml离心管若干，其中2个离心管做对照用。

• 按下表加入各种溶液，各溶液显色反应用量混匀后将1支对照管置暗处，其他各管迅速混匀，放置于光照培养室中反应10 min-30 min（保证各管受光情况一致，温度高时间缩短，温度低时间延长）。

  

4. SOD活性测定

• 至反应结束后，全部移入冰盒中，其上可覆盖遮光物，再冷冻离心12,000x g后取适量反应液测定。
• 以不照光的对照管作空白，分别测定其他各管的吸光度。

5. SOD活性计算
   计算公式：SOD (U/g.FW) = (Ack-AE) * VT/Ack/0.5/W/Vs
   公式中式符号表示：

• VT：总酶液量(ml)
• Vs：所用酶液量(50 μl)
• W：叶片鲜重(g)
• Ack：用缓冲液代替酶液的照光对照管吸光度
• AE：样品管吸光度