小型化CRISPR-Cas系统破解递送难题，基因治疗迎来新机遇

小型化CRISPR-Cas系统破解递送难题，基因治疗迎来新机遇

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中国科学院

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来源

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CRISPR/Cas9技术与腺病毒载体的结合，正在为基因编辑领域带来革命性的突破。这一创新不仅简化了基因编辑的操作流程，还显著提高了编辑的精确性和效率，为基因治疗和疫苗研发等领域带来了新的希望。

CRISPR/Cas9技术能够精准地编辑细胞中的基因，而腺病毒作为一种高效载体，可以携带CRISPR/Cas9系统进入目标细胞进行基因修饰。以下是运用腺病毒实现CRISPR/Cas9基因编辑的一般构建流程：

1. 设计靶向序列：首先，根据需要修改的基因确定一个适当的靶向序列，通常为20个核苷酸长度，并确保该序列在细胞基因组中的唯一性，以减少非特异性编辑的可能性。这个靶向序列将用于指导Cas9蛋白识别并切割基因组DNA。

2. 构建导向RNA(gRNA)：设计并合成含有目标靶点互补序列的导向RNA。gRNA是CRISPR/Cas9系统中的关键组件，负责将Cas9酶导向正确的基因位点。

3. 腺病毒载体的选择和制备：根据研究需求，选择一种适宜的腺病毒载体，例如Ad5或其他血清型的腺病毒载体。常见的腺病毒载体包括第一代、第二代和缺陷辅助型腺病毒。载体的构建包括插入gRNA表达盒以及Cas9蛋白的编码序列。

4. 克隆至腺病毒表达载体：在实验中，可通过重组DNA技术将gRNA和Cas9基因接入到腺病毒的表达载体，这通常包括利用限制性酶切位点或同源重组等策略。

5. 包装和放大腺病毒颗粒：涉及将重组的基因载体转染入包装线细胞(如HEK293)中，这些线细胞提供腺病毒生命周期所需的所有额外因子。转染之后，这些细胞将产生感染性的腺病毒颗粒，它们含有CRISPR/Cas9构件。进一步通过增殖、纯化腺病毒颗粒从而提供足够的病毒用于感染目标细胞。

6. 验证和滴度测定：在感染目标细胞之前，需要通过实验验证所构建的腺病毒是否正确表达gRNA和Cas9.通过PCR、测序等方法确认载体序列的正确性。随后，通过滴度测定来确定病毒的感染效率，常用的滴度测定方法包括荧光聚合酶链式反应(qPCR)和组织培养感染剂量50(TCID50)。

7. 目标细胞的感染：将验证过且测定滴度的腺病毒引入目标细胞进行感染。感染后，病毒将释放包含gRNA和Cas9的遗传材料进入细胞内，进而实现对特定基因位点的编辑。

8. 后续分析：感染后，通过一系列分子生物学和细胞生物学方法监测基因的编辑效果，包括实时PCR、Western blot分析Cas9蛋白的表达，以及利用T7内切酶实验和测序技术检测编辑位点。

9. 应用和功能验证：最后，通过各种细胞学和分子学技术验证CRISPR/Cas9介导的基因编辑对细胞功能的影响，如增殖、迁移、分化等实验。

CRISPR/Cas9技术与腺病毒载体的结合，在基因治疗领域展现出巨大的潜力。传统上，Cas蛋白体积较大，难以通过载体有效递送到目标细胞。为了解决这一问题，研究人员开发了小型化的CRISPR-Cas系统。

小型化的CRISPR-Cas系统通过筛选新型Cas蛋白、缩减蛋白结构域以及改造引导RNA等方式，成功解决了这一技术难题。例如，来自金黄色酿脓葡萄球菌的SaCas9只有1000多个氨基酸，显著小于传统的Cas9蛋白。这种小型化版本不仅能够有效包装进腺病毒载体，还能保持较高的编辑效率和特异性。

在实际应用中，小型化的CRISPR-Cas系统已被用于治疗多种遗传性疾病。例如，在输血依赖性β地中海贫血和镰状细胞病的治疗中，通过腺病毒载体递送的CRISPR/Cas9系统成功实现了基因编辑，为患者带来了新的希望。

在疫苗研发领域，CRISPR/Cas9技术与腺病毒载体的结合同样展现出令人振奋的前景。瑞士苏黎世大学与苏黎世联邦理工学院的研究团队通过设计小而强大的TnpB蛋白，开发出一种新型基因编辑工具。这种TnpB蛋白是Cas12的祖先，体积更小，编辑效率却提高了4.4倍。

研究团队通过两种方式优化TnpB蛋白：首先，使其更有效地进入基因组DNA所在的细胞核；其次，使其能够针对替代基因组序列。通过在10211个不同靶位点的测试，团队发现这种新型工具在小鼠肝脏中的编辑效率高达75.3%，在小鼠大脑中则达到65.9%。

更重要的是，由于其体积小，TnpB基因编辑系统可以包装成单个病毒颗粒，而传统的CRISPR-Cas9系统则需要多个病毒颗粒。这意味着使用TnpB可以降低载体剂量，减少潜在的副作用。

在动物实验中，这种新型工具成功编辑了一个调节胆固醇水平的基因，将实验小鼠的胆固醇水平降低了近80%。这一突破不仅展示了其在疫苗研发中的潜力，也为代谢性疾病治疗提供了新的思路。

CRISPR/Cas9技术与腺病毒载体的结合，正在为基因编辑领域带来革命性的突破。这一创新不仅简化了基因编辑的操作流程，还显著提高了编辑的精确性和效率，为基因治疗和疫苗研发等领域带来了新的希望。

随着技术的不断发展和完善，CRISPR/Cas9与腺病毒载体的结合有望在精准医疗和生物技术领域发挥更大的作用。未来，我们可能会看到更多基于这一技术的创新疗法和疫苗，为人类健康带来深远的影响。