如何养好细胞？贴壁细胞VS悬浮细胞

创作时间:

2025-01-22 06:28:08

作者:

@小白创作中心

如何养好细胞？贴壁细胞VS悬浮细胞

细胞培养是生物医学研究中的基础实验技术，根据细胞在培养容器中的生长方式，可以将细胞分为贴壁型和悬浮型两大类。本文详细介绍了这两种类型细胞的培养方法，包括复苏、传代和冻存等关键步骤，并特别提供了THP-1和RAW264.7两种常用免疫细胞系的培养攻略。

细胞复苏

冻存细胞较脆弱，要轻柔操作。一般采用快速融化原则复苏细胞，以保证细胞外结晶快速融化，避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

操作步骤：

从液氮罐或-80℃冰箱中取出冻存管，放入37℃水浴锅中解冻，并不时摇动（注意管口处高于水面，以免水进入导致污染），整个过程最好在1min以内；
将冻存细胞加入到含有5-10ml完全培养基的15ml离心管中，上下吹打数次，使冻存液与完全培养基充分混匀（若细胞对冻存剂(DMSO或甘油)敏感，离心去除冻存培养基，然后加入完全生长培养基中）；
800-1000 rpm离心2-3min；
弃上清，用完全培养基重悬细胞，并进行活细胞计数；
细胞接种于培养瓶或培养皿中，接种浓度10^6 /ml，置37 ℃细胞培养箱中静置培养，定时观察细胞培养情况（贴壁细胞复苏24h，若密度达到80%，则正常传代；若密度不到80%则继续培养到48小时再换液；悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液。）。

细胞传代

贴壁细胞传代操作步骤

用移液管或者巴氏吸管吸取培养液；
使用不含钙镁离子的平衡盐溶液（PBS）冲洗细胞1-2次；
弃PBS，加入胰蛋白酶-EDTA消化液（消化液浓度根据各细胞不同有调整），轻轻摇晃培养瓶，使胰酶与细胞表面充分接触，37 ℃孵育2-3 min，加入含血清完全培养基终止消化。
将细胞悬液移入离心管中，800 rpm-1000rpm离心5min，弃上清，加入预热的完全培养基重悬细胞，轻轻吸打混匀，吹打过程中尽量不要出现气泡。
细胞计数，根据细胞量选择合适的传代比例，最后转移置37 ℃细胞培养箱中进行培养。

悬浮细胞传代操作步骤

悬浮细胞由于本身在生长培养基中悬浮，无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离，整个过程较为迅速，对细胞损伤较小。悬浮细胞传代，通常有两种方法，直接传代法和离心传代法。

（1）直接传代法

① 悬浮细胞长满至80%-90%左右（细胞悬液变黄，最大细胞密度随细胞系不同而有所差异），即可传代；
② 用吸管吸弃细胞悬液1/2～2/3；
③ 加入适量的新鲜培养基，继续培养。

（2）离心传代法

① 将细胞悬液转移到离心管内；
② 800 rpm-1000rpm离心5min，弃上清；
③ 使用新鲜的培养基重悬细胞；
④ 吸管吸取适量细胞悬液，装入新的培养瓶，再加入适量的新鲜培养基，继续培养。

细胞冻存

细胞冻存是指将细胞放在低温环境，以达到减少细胞代谢的作用，从而达到对细胞进行长期储存进行保种的目的，以供后续实验或临床使用。细胞冻存一般采用慢冻原则，慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因为产生大的冰晶而收到损害。

原理

当温度低至-70℃时，细胞内的代谢活动及酶活性几乎全部停止，低于-130℃时，细胞能达到最佳存活率。液氮可实现细胞的长期保存。

冷冻保护剂二甲基亚砜（DMSO）能快速穿透细胞膜进入细胞，降低冰点，延缓冻存过程，同时增加细胞膜的通透性，提高细胞内离子浓度，减少细胞内冰晶的形成，从而达到保护细胞的目的。

贴壁细胞冻存操作步骤

预热冻存液；
用PBS冲洗细胞，加入胰酶消化（此步骤同细胞传代操作）；
终止消化后，重悬细胞，转移至无菌EP管，1000rpm离心5min；
弃上清，加入预热的细胞冻存液，细胞冻存最佳密度为5×10^6~1×10^7/ml，一般不低于5×10^5/ml；
分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；
将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；
将冻存管转移至液氮长期保存。

悬浮细胞冻存操作步骤

用移液管将细胞悬液吹吸均匀，将细胞悬液移入离心管；
1000rpm离心 3 min，收集细胞沉淀；
用预热的冻存液重悬细胞，细胞冻存最佳密度为3-5×10^6/ml，一般不低于5×10^5/ml；
分装完毕后，拧紧冻存管盖并做好标记；
将分装好的冻存管转入程序降温盒，放入-80℃冰箱过夜；
将冻存管转移至液氮长期保存。

注意事项

① 细胞培养、传代以及冻存需要严格的无菌操作。
② 传代时需要适度的消化，消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
③ 传代应在细胞处于对数期、未达到汇合状态时进行。
④ 细胞冻存液需提前配制，不可直接将DMSO加入细胞悬液中。
⑤ 应选择汇合度80%-90%左右，并且活力达90%以上处于对数生长期时的细胞进行冻存操作，确保细胞冻存时状态最佳，冻存密度可根据细胞特性进行调整。
⑥ 程序冻存盒、细胞冻存液、完全培养基等试剂都要复温至室温备用。
⑦ 冻存前注意切勿消化时间过长、吹打力度过重、离心转速过大或离心时间过长，以免造成细胞损伤。
⑧ 冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。
⑨ 细胞不可长期保存在-80℃冰箱中，放置时间不要超过3天。
⑩ 液氮或冰箱距离细胞房较远，细胞需要放在干冰或冰盒上运送至细胞房。

THP-1和RAW264.7细胞培养攻略

最近收到不少小伙伴的反馈：THP-1和RAW264.7细胞不好养，培养时出现了各种问题，下游实验进行不下去了。下面小恒总结了一份THP-1和RAW264.7细胞培养的攻略，希望能够帮助大家攻克THP-1和RAW264.7细胞培养的疑难杂症。

逐典TrypLUS消化液

逐典TrypLUS消化液是一种胰蛋白酶类似物（Trypsin Like Enzyme），是一种通过生物工程制备的非动物源性重组蛋白酶，与胰蛋白酶有相似的解离动力学，稳定性更高，纯度更好，消化更温和，细胞毒性更低。目前主要应用于细胞培养中，可以在赖氨酸和精氨酸的C末端切割肽键，可以替代猪或牛胰蛋白酶（Trypsin）对贴壁细胞的消化解离。生物制药中，GMP级别的TrypLUS能够为疫苗生产、病毒载体生产提供高质量和高性价比的贴壁细胞消化解决方案。