CRISPR/Cas9+数字PCR：精准育种迎来新突破

CRISPR/Cas9+数字PCR：精准育种迎来新突破

引用

光明网

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来源

1.

https://kepu.gmw.cn/agri/2024-05/30/content_37352642.htm

2.

http://www.genetics.cas.cn/dtxw/kyjz/202412/t20241202_7449054.html

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https://www.cnblogs.com/miyuanbiotech/p/18403053

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https://www.ibiogene.cn/news/253.html

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https://cn.novogene.com/novoxw/novoaljxcontent_438.html

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https://lifescience.sinh.ac.cn/202409/20240903.htm

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https://www.chinbullbotany.com/CN/figure/showFigure.do?fid=81051

8.

https://bbs.netbig.top/forum.php?mod=viewthread&tid=65272&extra=&mobile=1

2024年，荷兰瓦赫宁根大学研究团队在番茄育种领域取得重大突破：他们首次系统地研究了CRISPR/Cas9技术诱导染色体倒位的关键机制，并创新性地应用数字PCR技术进行高灵敏度定量分析。这一突破不仅揭示了基因编辑过程中染色体结构变异的规律，更为精准育种开辟了新路径。

CRISPR/Cas9技术被誉为“基因编辑的魔剪”，能够精确地在基因组中进行切割、插入或替换，为作物改良提供了前所未有的工具。然而，基因编辑效果的检测一直是个难题，传统的PCR技术灵敏度和准确性有限，难以满足精准育种的需求。

数字PCR（dPCR）技术的出现解决了这一难题。与传统PCR相比，数字PCR具有绝对定量、高灵敏度和特异性等优势，特别适合检测低丰度的基因编辑事件。在瓦赫宁根大学的研究中，研究人员选择了naica®微滴芯片式数字PCR系统，该系统能够将样品分割成数万个独立反应单元，每个单元中进行单分子扩增，从而实现对目标DNA分子的直接计数。

研究团队设计了十三个CRISPR/Cas9构建体，每个构建体含有两个靶向番茄染色体6特定位点的gRNA，一个是固定的参考gRNA，另一个是可变gRNA。通过这些构建体，他们成功诱导了一系列从1 kb到37.5 Mb不等的染色体倒位。

研究发现，倒位大小对诱导频率的影响微乎其微，除非大于1Mb的倒位。对于长片段的倒位，无论gRNA切割效率如何，其倒位频率都会大幅下降。研究人员认为，这可能是因为大尺寸片段在运输到修复部位的过程中受到阻碍。

为了验证倒位事件的发生，研究团队采用了双重检测方法：一方面利用数字PCR系统进行高灵敏度定量分析；另一方面通过Hi-Seq测序技术检测双链断裂位点的突变。两种方法的结果高度一致，进一步验证了数字PCR在检测低频基因组变化方面的可靠性。

染色体倒位是指染色体上某一段DNA序列发生180度颠倒的现象。在植物育种中，倒位既可能带来有利影响，也可能产生不利后果。

有利方面，倒位可以改变基因重组频率，从而影响特定性状的遗传。例如，河北农业大学和诺禾致源的研究团队在大豆中发现了一个与干旱适应性相关的倒位变异，这一发现为培育耐旱大豆品种提供了新的思路。

然而，倒位也可能对受精和胚胎发育产生不良影响，导致生育能力降低或产生遗传异常的后代。因此，精准控制倒位事件的发生频率和位置，对于育种实践至关重要。

CRISPR/Cas9与数字PCR技术的结合，为精准育种带来了新的可能性。通过精确控制基因组结构变异，育种专家可以更有效地改良作物性状，如产量、品质、抗逆性等。

此外，这种技术组合还能显著加速育种进程。传统的育种方法往往需要数年甚至数十年的时间，而通过基因编辑和高灵敏度检测，研究人员可以在较短时间内筛选出具有理想性状的植株。

尽管如此，精准育种仍面临一些挑战。例如，某些农业性状是由多个数量性状基因座共同决定的，仅编辑单个基因可能无法产生足够的表型变化。因此，开发有效的多重基因组编辑策略，实现多个有利等位基因的叠加，将是未来研究的重要方向。

瓦赫宁根大学的这项研究，不仅增进了我们对基因编辑过程中染色体结构变异的理解，更为植物育种提供了新的策略。通过调控倒位频率，可以更精准地改良作物特性，培育出更优质的番茄品种。这一突破有望为全球粮食安全和农业可持续发展做出重要贡献。