医用交联透明质酸钠凝胶微球的制备及性能研究

医用交联透明质酸钠凝胶微球的制备及性能研究

医用交联透明质酸钠凝胶微球是一种重要的生物医学材料，广泛应用于微整形、组织填充等领域。本文通过乳化法制备医用交联透明质酸钠凝胶微球，对HA起始浓度、乳化转速、乳化时间、乳化剂浓度及油水相比等参数进行初步研究，并对参数进行适当调整和优化，在较为理想的乳化条件下制备出符合性能要求的医用交联透明质酸钠凝胶微球。

透明质酸（hyaluronicacid，HA），又称玻尿酸，是由N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸通过糖苷键交替连接而成的大分子酸性粘多糖。透明质酸多分布于哺乳动物的结缔组织和体液中，是构成皮肤细胞间质的成分，其通常以透明质酸钠盐的形式存在。透明质酸主要是由动物组织提取和微生物发酵两种途径制备得到。HA分子中含有较多羟基和羧基，赋予了其很好的保湿性和清除自由基的功能，被广泛用于化妆品中。但由于透明质酸在组织间易被扩散和降解，体内存留时间短，难以充分发挥其物理化学特性，在实际应用中具有一定的局限性。为了弥补这些缺陷，需要对透明质酸进行化学修饰或交联，从而得到性能更优异的透明质酸衍生物。透明质酸衍生物被应用于微整形、组织填充、药物缓释、控释载体等领域。

为获得充分、均匀的反应体系，以二乙烯基砜为交联剂，采用乳化法制备医用交联透明质酸钠凝胶微球，考察了乳化转速、乳化时间、油水比、乳化剂浓度、透明质酸钠起始浓度等因素对凝胶微球粒径的影响。在相对优异的条件下，制备出粒径均匀的交联透明质酸钠凝胶微球，对其相关性能进行检测，检测结果符合《整形手术用交联透明质酸钠凝胶》（YY/T 0962-2014）要求。为工业化制备交联透明质酸钠凝胶微球提供一些数据参考。

实验

试剂及仪器

透明质酸钠 （华熙福瑞达生物医药有限公司）；二乙烯基砜（Sigma-Aldrich Co.LLC）；氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；span80（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；液体石蜡（江苏强盛功能化学股份有限公司）；环己烷、无水乙醇（永华化学科技（江苏）有限公司）；AE500S-P实验室剪切乳化机；CV0100马尔文流变仪；HG1697推拉力机；数显颗粒图像分析仪。

实验方法

（1）水相：称取一定量透明质酸钠干粉于烧杯中，分多次加入1%氢氧化钠溶液，搅拌1 h，至透明质酸钠溶解完全，透明，肉眼观察无不溶解颗粒物。

（2）油相：称取一定量的液体石蜡和span80，两者按照一定比例称取，搅拌均匀。

（3）将溶解后的透明质酸钠碱性凝胶转移到油相烧杯中。设置好乳化转速和时间，使用乳化机对油水混合相进行乳化。

（4）乳化结束，向乳液中加入一定量的交联剂二乙烯基砜，室温搅拌2 h，于50℃下反应2～4 h。交联反应结束，待乳液冷却，先后使用乙酸乙酯和无水乙醇对乳液进行清洗处理，静置分层，倒去上清液，除去残留液体石蜡及span80。将得到的凝胶颗粒溶于磷酸盐缓冲液中，溶胀过夜。倒去上清液，收集下层交联透明质酸钠凝胶微球，采用显微计数法统计微球的粒径，每次计数不少于300粒。将凝胶微球灌装于1.0 mL注射器中，进行高压蒸汽湿热灭菌（121℃，15 min）。

性能检测

1.3.1 粘弹性

取适量凝胶样品，采用马尔文流变仪进行测定。在25℃下，在0.05～10 Hz范围内，绘制弹性模量G和粘性模量G〃的对数与频率的对数坐标图，在1.0 Hz频率下的粘性模量和弹性模量。

1.3.2 推挤力

将27G注射针安装到注射器上，模拟实际使用情况。以20 mm/min恒定速度推动推进杆，注射器中的样品经由针头被推挤出，得到推挤力曲线。由推挤力曲线可以看出样品挤出过程中推挤力大小及样品分散均匀情况。

1.3.3 溶胀度

称取适量凝胶样品，在105℃温度下烘干至恒重，称量恒重质量m1。滴加纯化水至溶胀完全后，用吸水纸吸取多余的水分，称量溶胀后的质量m2。溶胀度计算公式为

结果与讨论

HA起始浓度对粒径的影响

HA起始浓度是影响透明质酸钠乳化反应效果的因素之一，不仅对交联效果起重要作用，而且对凝胶微球的粒径起关键作用。当HA浓度低于1%时，透明质酸钠在乳液体系中很难形成有规则的凝胶。本节选用1%、3%、5%、8%、10%五个不同浓度，在固定其他参数的条件下进行实验，比较不同HA起始浓度下制得的凝胶微球粒径，如图1。由图1看出，当HA起始浓度为8%时，所制备的凝胶颗粒平均粒径为38.0μm。

Chart 1 The effect of HA initiation concentration on gel-particle size

乳化时间对粒径的影响

在乳化过程中，分散相在高速乳化实验机外力的作用下，经过一定时间才能形成均一粒径、稳定的乳液。为了得到预期粒径的交联透明质酸钠凝胶颗粒微球，需要对乳化时间进行控制，在固定其他参数的条件下，以5 min为间隔，选取5～25 min间的5个时间点进行实验，乳化时间对粒径的影响如图2所示。从图2可以看出，在固定其他实验参数的条件下，不同乳化时间对凝胶粒径的影响较大。当乳化时间为20 min时，所得凝胶平均粒径较小，粒径为26.2μm。乳化时间过短，凝胶还未形成有效分散；乳化时间过长，会导致乳液不稳定，进而导致乳液微滴的粘连。

Chart 2 The effect of emulsion time on gel-particle size

本节实验选取不同的油水比，在固定其他因素条件下，进行一系列实验，结果见图3。凝胶微球的平均粒径随着油水比的增加而变小，两者间呈现一定的关联性，油水比越小，油相分散能力越强，所制备凝胶的平均粒径越小。当油水比为1/4时，凝胶微球平均粒径为40.0μm。

Chart 3 The effect of oil/water ratio on gel-particle size

乳化剂浓度对粒径的影响

乳化剂可以有效降低两相界面的张力，促进相互分散，有利于凝胶颗粒的形成。本实验选用span80作为乳化剂，在实验过程中，固定其他条件，针对乳化剂对凝胶粒径的影响进行研究。由图4可以看出，在一定初始范围内，凝胶微球的平均粒径随着乳化剂浓度的增加而快速变小，当乳化剂达到一定浓度后，凝胶微球平均粒径基本不变。当乳化剂浓度为1.5%时，凝胶微球平均粒径为48μm。

Chart 4 The effect of emulsifier concentration on gel-particle size

乳化转速对粒径的影响

在乳化实验过程中，选用5个不同乳化转速，固定其他反应参数，得出如图5结果。在特定乳化转速范围内，凝胶微球的平均粒径随着乳化转速的提高而变小。当乳化转速较低时，不能有效分散成乳液；增加转速，剪切力增大，乳液不易沉降，从而形成均匀粒径的凝胶微球。当乳化转速为2500 r/min时，凝胶微球平均粒径达到56 μm。

Chart 5 The effect of stirring speed on gel-particle size

性能检测

在各因素设定为较佳实验参数下（透明质酸钠起始浓度为8%、油水比为1/4、乳化剂浓度为5%、乳化转速为2500 r/min、乳化时间为20 min）制备交联透明质酸钠凝胶微球，对其主要性能进行检测，结果见表1、图6～图8。

Diagram 1 performance test

Chart 6 gel-particle size distributions

Chart 7 push force of the gel

Chart 8 Viscoelasticity of the gel

结论

通过乳化法制备医用交联透明质酸钠凝胶微球，对HA起始浓度、乳化转速、乳化时间、乳化剂浓度及油水相比等参数进行初步研究，并对参数进行适当调整和优化，在较为理想的乳化条件下制备出符合性能要求的医用交联透明质酸钠凝胶微球。所制备的医用交联透明质酸钠凝胶微球样品性能稳定，粘弹性较低、推挤力较小且平稳。在面部整形手术中，可以得到很好的效果。本方法工艺简单，实验过程易于控制，反应条件温和，解决了交联反应不均匀的问题。该方法可以进行快速放大生产，便于工业化生产，所制备的医用交联透明质酸钠凝胶微球具有良好的应用价值。