免疫荧光技术：从原理到实验设计的全面解析

免疫荧光技术：从原理到实验设计的全面解析

免疫荧光技术是一种将荧光染料与特异性抗体相结合，用于检测和定位生物样本中特定抗原的技术。该技术在生物学、医学和生命科学研究中具有广泛的应用，能够帮助研究人员观察细胞和组织中的蛋白质分布、监测基因表达水平以及研究细胞信号传导等。本文将详细介绍免疫荧光技术的基本原理、检测方法、实验操作要点以及结果分析等内容。

一、反应原理

免疫荧光技术以抗原抗体特异性反应原理为基石构建而成。首先，把荧光素巧妙地与已知的抗原或者抗体相连接，使其成为带有荧光标记的特殊探针。随后，运用该荧光抗体（亦或是荧光抗原）对血清、体液、细胞以及组织中的对应抗原（或者抗体）展开精准探测。当在组织或细胞内部，抗原与抗体成功结合形成复合物时，此复合物便携带上了标记的荧光素。一旦受到外界激发光的照射，荧光素便会释放出荧光。凭借对荧光强度的精准测定以及对表达位置的精确观察等多方面指标的综合考量，进而实现对目标抗原或抗体的定性鉴别与定量测定。

二、检测方法

01 直标抗体检测

荧光基团直接与一抗进行偶联。其具备方法简易便捷、特异性极为突出的显著优势。然而，该方法也存在一定局限性，所获取的信号往往相对微弱，敏感性处于较低水平，而且每针对一种抗原展开检测，便需要专门制备与之对应的一种荧光抗体。这种方法在实际应用中，常常被用于细菌、病毒等各类微生物的快速筛查检验工作，以及肾炎活检、皮肤活检过程中的免疫病理检查领域，为相关疾病的快速诊断与病情评估提供了重要的技术支持与依据。

02 间接染色法

最为常用的操作流程包含两个关键的孵育步骤：其一，一抗精准地与目标表位相互结合；其二，荧光基团标记的二抗能够准确地识别并与一抗相结合，由此便构建形成了抗原 - 特异性抗体 - 标记荧光抗体的复合物结构。

03 多色免疫荧光

三、样本制备及注意事项

免疫荧光实验涵盖了一系列关键步骤。首先是样本制备，这是实验的基础环节，旨在获取合适的研究材料。接着进行固定及通透（或透化）操作，固定可使样本保持原有形态结构，而通透处理则有助于后续抗体能够顺利进入细胞内部与相应抗原结合。随后进入封闭步骤，其目的在于减少非特异性结合，提高实验的准确性。完成封闭后，便是抗体孵育阶段，让特异性抗体与样本中的目标抗原充分反应。最后进行荧光检测，通过检测荧光信号来确定抗原的存在、定位及表达情况等。对于石蜡切片而言，由于其特殊的处理过程，需要先进行脱蜡处理以去除石蜡对实验的干扰，然后进行修复处理，恢复抗原的活性与可及性，之后才依次开展封闭、抗体孵育等后续步骤，如此才能确保整个免疫荧光实验的顺利进行与结果的可靠性。

1. 样本准备：

• 细胞准备：在处理单层生长细胞时，于传代培养之际，需将细胞接种于预先放置了经特殊处理之盖玻片的培养皿内。当细胞生长至接近单层状态时，小心取出盖玻片，以磷酸盐缓冲液（PBS）轻柔冲洗两次。此过程中，细胞密度的把控至关重要，若密度过高，细胞会彼此过度挤压，致使细胞形态扭曲、边界模糊难辨，同时染色背景也会因之加深。反之，倘若细胞数量过少，细胞活性将大打折扣，进而极易引发非特异性染色现象。故而，在进行染色操作时，细胞密度以 80% 左右为宜。而对于悬浮生长的细胞，则需选取处于对数生长期的细胞，运用 PBS 进行离心洗涤操作（离心速度 1000rpm，时长 5 分钟），重复两次后，借助细胞离心甩片装置制备细胞片，或者直接制备细胞涂片以便后续实验开展。

• 石蜡切片：在动物处死后，应在尽可能短的时间内（理想状况下为 2 小时之内）完成取材工作，并即刻进行固定处理，组织的固定时长切不可超出一周。石蜡块建议现用现切，所选用的玻片务必为粘附载玻片，以此确保切片的稳定性。组织切片要求平整光滑且无气泡产生，厚度以 5μm 左右为佳。切片完成后，需进行长达 3 小时的烤片操作，有效防止后续实验过程中出现脱片现象。在正式开展实验前，应当先针对切片实施脱蜡以及修复处理工序，之后才可以进行通透与封闭步骤。

• 冰冻切片：同样需要在动物处死后迅速取材，取材完毕后，利用滤纸仔细吸除组织表面多余的水分，随后对组织进行快速冷冻处理，这样做能够有效减少组织内部冰晶的形成，与此同时，还能够较好地维持细胞内酶的活性。切片应尽可能保证平整且无破损，厚度在 6 - 8μm 之间为宜，并且需采用防脱载玻片。切片完成后，要立即将其放置于固定液中进行固定，然后使用自来水缓慢小心地冲洗（注意切勿直接对着组织冲洗），以此防止切片发生脱落情况，确保实验的顺利推进。

2. 固定：

化学固定剂主要分为交联试剂以及可单独使用或联合运用的有机溶剂这两大类。

• 交联类固定剂以醛类物质为代表，其醛基能够与蛋白质发生交联反应，进而构建起亚甲基交联网络，以此确保蛋白质的位置与形态得以稳固维持。不过，采用这类固定剂固定后，还需要对细胞进行通透处理，以便后续步骤顺利开展。

• 有机溶剂类固定剂如甲醇、丙酮等，它们主要通过去除脂质、使细胞脱水、变性以及沉淀细胞成分等方式来实现对组织的固定。由于有机溶剂具备渗透细胞膜的能力，所以在使用这类固定剂时，无需再借助 Triton X - 100 进行通透操作。

在细胞固定方面，可将细胞置于 100% 甲醇（需在 - 20℃冷冻）或者丙酮中孵育 15 - 20 分钟，这种方法较为适用于对细胞骨架成分展开研究。

固定液的挑选需要综合考量被研究抗原的性质以及所用抗体的特性。当前，4% 甲醛是较为常用的固定液，其在研究细胞膜蛋白时效果显著。同时需要留意的是，固定液试剂具有挥发性，所以在固定过程中务必防止切片干涸。

3. 通透：

通透的实质是在细胞膜上制造孔洞，从而使抗体能够更为便捷地进入细胞内部与抗原相结合。鉴于甲醇等有机溶剂本身具有溶解脂质的功能，所以在使用这类固定剂时无需进行额外的通透处理。而对于使用交联剂（例如多聚甲醛）固定后的细胞，通常在加入抗体孵育之前，需要对细胞进行通透处理。在选择通透剂时，必须充分考量抗原蛋白的性质，一般可选用 0.1% - 0.2% 的 Triton X - 100 进行通透，通透时间大致控制在 20 分钟左右，通透完成后需用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

4. 封闭：

为有效规避内源性非特异性蛋白抗原的结合，在孵育一抗之前需要进行封闭处理，以此降低非特异性背景着色现象的出现。封闭液既可以选用与二抗来源相同的血清，也可以使用 1% - 5% 的牛血清白蛋白（BSA）来替代。

5. 一抗与二抗孵育：

一抗的挑选应当选取适用于免疫荧光（IF）技术且反应种属涵盖本实验样本种属的抗体，一抗孵育以 4°C 为宜（时长为 12 - 16 小时），这样能够有效减少非特异性结合。此外，抗体浓度需要进行优化调整，浓度过高会致使背景信号过强，浓度过低则会造成目标信号微弱。荧光二抗优先考虑选择预吸附抗体，这样可以最大程度减少交叉反应。特别需要注意的是，从孵育二抗开始直至实验结束的整个过程都必须严格避光操作。

6. DAPI 染核：

核染色时应确保亮度适中，染核结束后进行清洗操作，随后使用荧光淬灭剂进行封片处理。

7. 洗涤步骤：

在整个免疫荧光实验过程中，洗涤步骤起着极为关键的作用。每次洗涤时长约为 5 分钟左右。由于细胞和冰冻切片相对较为脆弱，所以在洗涤时动作不宜过于剧烈。同时，在整个实验过程中都要时刻留意防止切片干涸，以此避免背景着色现象的加剧。

四、双标 / 三标实验设计

01 直接法

在直接法中，把两种各自偶联了不同荧光素的抗体（例如抗 A 抗体和抗 B 抗体）依照恰当的比例予以混合，之后开展孵育操作。如此一来，这两种抗体便能在孵育过程中分别与对应的抗原相结合，凭借不同荧光素所发出的特定荧光信号，从而实现对两种不同抗原的同时检测与定位。

02 间接法

间接法首先是将未带有荧光标记的两种一抗混合后进行孵育，并且要确保最终各抗体的终浓度达到实验所适宜的浓度标准。待一抗与抗原充分结合之后，再加入两种分别偶联了不同荧光素的对应二抗继续孵育。通过这种间接的方式，借助二抗对一抗的特异性识别与结合，使得荧光信号得以有效放大，进而能够更为清晰地观测到抗原的存在与分布情况。

搭配示例：

针对抗原 A，采用小鼠来源的一抗，后续使用山羊抗小鼠荧光二抗 488 与之匹配；对于抗原 B，则运用兔来源的一抗，相应地搭配山羊抗兔荧光二抗 594；而抗原 C 选用大鼠来源的一抗，配合山羊抗大鼠荧光二抗 647。这样的搭配组合能够在保证特异性的基础上，利用不同荧光素的特性，实现对多种抗原的同时检测与区分。

03 注意

其一，所使用的一抗必须源自不同的种属，这是确保实验准确性与特异性的关键所在。同时，荧光标记二抗与一抗的种属需要精准匹配，并且二抗之间不能存在交叉反应，否则将会导致实验结果出现混淆与错误。

其二，两种抗体所携带的荧光素其激发发射波长最好不存在交叉现象。这是因为若波长有交叉，在荧光检测过程中就难以清晰地分辨出不同荧光素所对应的抗原信号，从而影响对多种抗原的准确检测与定位。

其三，在开展多标实验之前，必须先对单标实验在特定组织或细胞中的有效性进行验证。只有确保单标实验能够准确地检测到相应抗原，才能进一步进行更为复杂的多标实验，以此提高整个实验的成功率与可靠性。

04 实验设计对照

为了切实保障荧光染色结果的正确性与可靠性，在首次开展此类实验时，设置对照实验是必不可少的环节，其主要目的在于有效排除非特异性荧光染色所带来的干扰因素。

1. 标本自发荧光对照：取标本并滴加 0.01mol/L，pH 值为 7.4 的 PBS 进行孵育，在最后使用封片剂进行封片处理，然后通过荧光显微镜对组织进行观察。若在组织内观测到荧光现象，则将其称为自发荧光。通过设置该对照，可以明确组织本身在未进行特异性染色时是否存在荧光信号，从而在后续实验结果分析中排除这一因素的干扰。

2. 阴性对照：与阳性对照恰恰相反，选取明确不含有待测抗原的细胞或组织切片进行染色处理。若最终染色结果呈现阴性，那么就能够排除在染色过程中由于非特异性染色而导致的假阳性结果出现。这一对照对于判断实验过程中是否存在非特异性结合以及试剂是否存在杂质等问题具有重要意义。

3. 阳性对照：选用已经确认含有待测抗原的组织或细胞，使其与待测标本一同进行统一的处理流程。若阳性对照的结果呈现阳性，这便能够有力地证明待测抗原具有一定的活性，并且在整个实验过程中所使用的试剂以及所采用的方法均是可靠有效的。通过阳性对照的设置，可以为实验结果的准确性提供有力的支撑与保障。

五、结果显示与样本保存

通过荧光显微镜观察到的图像，在判定结果时主要依据两个关键指标。其一为形态学特征，借助这一指标能够对蛋白的分布范围以及它们之间的空间相互关系展开相应的评价；其二则是荧光的亮度，而在实际判定结果的过程中，绝不能孤立地看待这两个指标，必须要将二者有机结合起来，进行综合性的考量与判定，如此才能得出准确可靠的结论。

关于荧光强度的表示方法具体如下：

• 当标记为 “＋＋＋ ～ ＋＋＋＋” 时，意味着所观察到的荧光呈现闪亮状态，颜色上表现为十分明显的亮绿色，此时荧光强度相对较高，表明对应蛋白的表达情况或相关反应较为显著。

• 标记为 “＋＋” 的情况，其荧光明亮，展现出的是黄绿色，代表着荧光强度处于中等水平，相应地反映出蛋白在该样本中的存在及表达情况处于适中程度。

• 若标记为 “＋”，则表示荧光相对较弱，不过依然能够清楚地被观察到，说明对应的蛋白表达量或者相关反应程度相对没那么强烈，但仍可被检测出来。

• 而标记为 “±” 的情况，所呈现出的是极弱的可疑荧光，这意味着荧光信号非常微弱，有可能存在相应蛋白，但也可能只是一些干扰因素导致的微弱信号，需要谨慎判断。

• 最后，标记为 “－” 代表无荧光出现，也就表明在当前观察条件下，没有检测到与该染料对应的蛋白或者相关反应，从侧面反映出可能不存在相应的目标物质或者相关反应未发生。