科普讲堂 | 一起了解一代测序的原理及应用

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一代测序，也称为Sanger测序法是 DNA 测序技术的“金标准”，曾在人类基因组计划中发挥了关键推动作用，并且在现在仍被用来获得高度准确且可信赖的测序数据。

原理介绍

Sanger测序法，是一种传统的测序技术，它具有读长较长（800-1000bp），碱基读取准确率高，结果直观、对信息分析要求较低等特点。

其原理基于DNA聚合酶在DNA模板上合成一条新的DNA链。在这个过程中，通过加入特殊的二进制脱氧核苷酸三磷酸酯（dNTPs），当新链中遇到这种特殊的核苷酸时，DNA聚合酶会停止合成。通过测定这些停止的位置，就可以确定DNA序列。

Sanger测序法的核心在于使用双脱氧核苷酸（ddNTPs），这些分子在5'和3'位置都不含羟基，因此在合成核酸链的过程中无法形成磷酸二酯键，从而导致DNA合成反应中断。在测定待测核酸片段的序列时，向反应体系中加入一定比例的带有放射性同位素标记的4种ddNTPs，利用DNA聚合酶来延伸结合在待测核酸模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止。最终会得到一组长度各相差一个碱基的链终止产物。这些产物可通过高分辨率变性凝胶电泳分离并根据其长度排序，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影进行检测，从而确定目的核酸片段各个位置的碱基。

优势与劣势

优势：

1. 测序长度长，最长可达1000 bp；
2. 价格便宜，周期快，适合低通量样本的研究；
3. 仪器成本相对较低；
4. 对800 bp以内DNA序列上的碱基变异可以精准检测；
5. 准确性高，过程细致，质控环节多，不容易污染，测序结果直观可视。

劣势：

1. 测序通量低，第一代测序技术一个反应只能得到一条序列；
2. 对于大量测序成本略高：第一代测序技术虽然单个反应价格低廉，但是获得大量序列的成本很高
3. 难以检出高GC和重复序列区域；
   4.不能检出大片段缺失和拷贝数变异等基因突变类型。

临床意义及应用

临床意义

一代测序技术不仅在生物科学研究中有广泛的应用，如基因组学研究、蛋白质组学研究、疾病研究、物种鉴定和系统进化研究以及生物种群遗传学研究等。而且，由于其高准确率和低假阳性率的特点，至今仍被认为是在进行基因检测时的金标准。

应用

1. PCR产物测序：对目的基因的PCR产物进行测序，得到目的基因序列；
2. 重测序：突变、SNPs、插入或缺失克隆产物的验证；
3. 分型分析：微生物和真菌分类学鉴定、HLA分型、病毒分型等；
4. 临床应用：肿瘤突变基因的检测和肿瘤个体化治疗，致病基因位点明确并且数量有限的单基因遗传病检测；
5. 对新一代测序技术的结果进行验证。