qPCR实验的Ct值合理范围及异常处理方法

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https://www.yeasen.com/news/detail/76

Ct值是荧光定量PCR（qPCR）实验中一个重要的结果指标，用于计算基因表达量差异或基因拷贝数。那么，什么样的Ct值才是合理的？如何保证Ct值的有效范围？本文将为您详细解答。

Ct值，即Cycle Threshold，是指在qPCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。简单来说，Ct值就是qPCR中起始模板扩增达到一定产物量时所对应的循环数。

Ct值的主要作用包括：

指数扩增与模板量的关系：理想情况下，qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累，扩增循环数和产物量之间的关系是：扩增产物量=起始模板量×（1+Eⁿ）^循环个数。当扩增产物量达到“一定产物量”时，此时循环个数为Ct值，处于指数扩增时期。Ct值与起始模板量的关系是：模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系。起始模板量浓度越高，Ct值越小；起始模板量浓度越低，Ct值越大。
扩增曲线与荧光阈值：qPCR扩增产物量是以荧光信号的形式直接呈现，也就是扩增曲线。在PCR早期，扩增处于理想情况下，循环数较少，产物积累少，产生荧光的水平不能与荧光本底背景明显地区别，之后荧光的产生增加进入指数期。可以在PCR反应刚处于指数期的某一点上来检测PCR产物的量，以此作为“一定产物量”，并且由此来推断模板最初的含量。因此，一定产物量对应的荧光信号强度，也就是荧光阈值。

在PCR的后期，扩增曲线不再呈现指数扩增，进入线性期和平台期。

Ct值的重现性：PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期，此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

扩增效率En：PCR扩增效率是指聚合酶把待扩增基因转变生成扩增子的效率。由1个DNA分子转变生成2个DNA分子时的扩增效率为100%。扩增效率常用En表示。影响扩增效率的因素包括PCR抑制剂、引物设计、反应程序、试剂混匀情况、扩增子长度以及qPCR试剂等。
Ct值的范围：Ct值的合理范围通常为15-35。Ct值小于15，认为扩增在基线期范围内，未达到荧光阈值。理想情况下，Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系，也就是标准曲线。通过标准曲线，扩增效率为100%时，计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右，若大于35，理论上模板起始拷贝数小于1，可认为无意义。