高GC含量片段的PCR扩增问题及解决方案

高GC含量片段的PCR扩增问题及解决方案

在分子生物学研究中，PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的DNA扩增技术。然而，当面对高GC含量的DNA片段时，PCR扩增往往会遇到诸多挑战。本文将探讨高GC含量片段扩增面临的问题，并介绍多种有效的解决方案。

不知道大家在扩增富含 GC 的 DNA 区域时是否遇到问题？几十年来，通过 PCR 扩增富含富含 GC 的区域的问题一直是科学家们的烦恼！

首先，让我们看看为什么富含 GC 的序列更难扩增。

问题 1：热稳定性和结构稳定性

当我们说“富含 GC”时，我们的意思是大约 60% 的碱基是胞嘧啶 （C） 或鸟嘌呤 （G）。富含 GC 的 DNA 序列本质上比 GC 含量低的序列更稳定。对于 PCR，这意味着 GC 含量越高，DNA 的熔点就越高。

与普遍的看法相反，富含 GC 的 DNA 序列稳定性的提高主要不是因为氢键。稳定主要是由于称为基础堆叠的堆叠交互。这种堆叠发生的背后涉及生物化学和生物物理学。这就是为什么嗜热热藻（一种需要耐受非常高环境温度的极端微生物）具有富含 GC 的基因组的原因。这也是为什么我们基因组中需要经常转录的区域——例如高表达基因的启动子区域——是富含 AT 的，就像 TATA 盒子一样。

问题 2：二级结构的形成

这一点与第一点密切相关。当富含 GC 的区域形成二级结构，尤其是发夹环时，它们非常稳定，因此它们会粘附并积累。此外，这些二级结构在通常的 PCR 变性温度下不能很好地熔化。

此外，用于扩增富含 GC 的区域的引物往往会形成自二聚体和交叉二聚体以及茎环（或发夹）结构，这些结构会阻碍 DNA 聚合酶沿着模板分子的进展，从而导致 PCR 产物截短。引物 3' 端富含 GC 的序列也会导致错误引发。

解决方案 1：提高熔解温度

这是一个非常明智和简单的解决方案（至少在理论上是这样）。熔解温度越高，由富含 GC 的区域形成的麻烦的二级结构就越有可能分离。

但是，请小心，因为这可能会导致产物的产量降低！这是因为选择的酶（进行扩增）在超过 92.5°C 的温度下可以更快地开始变性。因此，建议在最初的几个循环中仅使用较高的熔解温度，并绝对避免超过 95°C。

解决方案 2：调整镁浓度

一般来说，在 PCR 反应中使用过量浓度的镁会加剧甚至导致非特异性扩增。因此，最好使用梯度或滴定 PCR 来测试最佳浓度。简而言之，绝对左侧的管的镁含量应低于认为有效的镁含量，而绝对右侧的管应含有过量的镁。这允许在中间形成一个梯度，因此您可以确定可用于实现产品的最低可能量。

解决方案 3：在 PCR 反应中使用添加剂

研究人员可能改善扩增富含 GC 的区域问题的另一种方法是在 PCR 反应中使用添加剂。这些可以包括 DMSO、甘油和 BSA 等添加剂。但是，关于这些添加剂没有硬性规定;它们的作用可能高度可变，具体取决于特定靶标、循环条件以及用于扩增的特定 PCR 酶和缓冲液。

解决方案 4：更换聚合酶或缓冲液

一些公司已经开始开发专门用于扩增富含 GC 的区域的缓冲液和聚合酶。NEB 的 OneTaq GC 缓冲液就是这样一个例子。该缓冲液可以进一步补充高 GC 增强剂。其他公司已经优化了新的聚合酶，以帮助扩增富含 GC 的区域。ThermoFisher 开发了 AccuPrime™ 富含 GC 的 DNA 聚合酶，该聚合酶源自富马里古细菌 Pyrolobus fumarius。与 Taq DNA 聚合酶相比，该聚合酶具有更高的持续合成能力。它在 95°C 下 4 小时后仍保持活性，因此可以将其与我们提高熔化温度的第一个技巧相结合！

解决方案 5：完全更改 PCR 方法

研究人员还开发了在富含 GC 的模板上进行 PCR 的全新方法，以提高其成功率。一个这样的例子被称为 Slow-down PCR。慢速 PCR 需要添加 7-deaza-2′-deoxyguanosine，一种 dGTP 类似物，用于 PCR 混合物。慢速 PCR 还使用不同温度的标准化循环方案。通常，与更标准的 PCR 程序相比，升温速率会降低，并且 PCR 运行周期更长。