三代纳米孔测序优势分析：长读长技术的革命性突破

三代纳米孔测序优势分析：长读长技术的革命性突破

三代纳米孔测序技术是近年来生物技术领域的重大突破，它通过捕捉离子电流信号来识别碱基序列，实现了超长读长的测序能力。与传统的二代测序技术相比，三代测序在读长、样本处理方式等方面展现出显著优势。本文将从技术原理出发，深入解析三代纳米孔测序的核心优势。

原理回顾

三代测序，也称为纳米孔链测序法，其基本原理是将单个核酸分子在电场力驱动和马达蛋白控速的双重作用下，以连续的单链核酸形式穿过纳米尺寸的蛋白孔道。当不同碱基通过时，会对孔道内的离子电流产生不同程度的阻断，因此可以通过捕捉随时间变化的电流信号实时地识别其碱基排列信息，从而实现对单链核酸分子的测序。

产品优势

长读长

三代纳米孔测序的读长可以超过150Kb，甚至达到Mb级别。这种超长读长的优势源于其独特的技术原理：测序读长完全取决于输入片段的长度，而不受设备或芯片的限制。目前，三代测序技术普遍可以实现超过150个碱基，甚至达到10^6个碱基的超长读长。

相比之下，二代测序技术如华大的纳米球技术和illumina的DNA簇技术都存在读长限制。例如，illumina的DNA簇技术通过桥式PCR生成的簇长度是有限的：

华大的纳米球（DNB=DNA Nano Ball）技术虽然看起来像毛线团一样很长，但实际上每个复制圈的长度就是其读长：

因此，华大芯片上的纳米球应该类似于黑人小哥的方便面头：

无论是DNA簇还是DNA纳米球，它们的生成都依赖于PCR过程，测序过程也依赖于一轮一轮的PCR反应（加一种碱基发出一种光），这种程序化的底层原理决定了它们属于短读长技术。例如，illumina NextSeq 550的读长最长为150bp，双端测序可以达到600bp：

不同仪器使用的芯片也不同：

华大明星产品G99芯片的选择：

为了得到所需的短DNA片段，二代测序通常采用酶法或超声法进行前处理。酶法通过限制性内切酶特异性切割DNA，而超声波打断则通过机械方式随机切断DNA。目前普遍采用超声打断法，因为测序质量更为重要。例如，使用比利时知名品牌Bioruptor Pico全自动超声波破碎仪：

酶法打断的优缺点：

• 优点：高通量，可一次性处理多个样本，操作简便
• 缺点：偏好性严重，对样本质量要求高

超声波打断的优缺点：

• 优点：片段随机打断，无偏好性
• 缺点：成本高，机械损伤大

在二代测序中，为了获得合适的片段长度，通常需要将DNA打断成300-500bp的片段，然后通过磁珠筛选进一步优化片段分布。例如，SYSU星空在公众号“微生态与微进化”中提到，微生物基因组DNA经过90s超声波打断成约350bp的小片段，建库后的文库片段（加上接头为500bp左右）经Agilent 2100测试长度分布如下：

从图中可以看出，真正希望回收的片段范围非常狭窄，其他片段都被浪费。这种操作不仅消耗大量人力、物力和时间，还会对DNA造成较大损伤，特别是对于珍贵样本如单细胞样本或FFPE标本。

相比之下，三代测序的优势显而易见。三代测序可以采用直接测序方式，即DNA提取后无需片段筛选，直接进行建库测序。虽然这种方式对于大基因组样本数据产量较低，但可以通过简单的方法如使用g-TUBE（一种特制的离心管）进行片段打断，控制离心条件来获得合适大小的片段。此外，还可以使用bluepippin等仪器来富集大片段，进一步提高测序质量。