蓝白斑筛选的原理和几个常见翻车原因

蓝白斑筛选的原理和几个常见翻车原因

为什么做蓝白斑筛选？

在挑选阳性克隆质粒时，往往会出现挑取的克隆阳性率较低的情况，并且只有在经过测序后才会知道克隆是否为阳性，为了更方便地挑取阳性克隆，可以 通过蓝白斑筛选来精准地挑取阳性重组克隆 。

蓝白斑筛选的原理：

LacZ基因编码β-半乳糖苷酶，可以水解X-gal（5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）产生蓝色 。

LacZ基因可以拆分成N端和C端两部分，N端是LacZα，通常位于载体质粒上，LacZα上有多克隆区（MSC）。C端在宿主菌里。

如果空载体转化后， 由于β-半乳糖苷酶的α-互补性，LacZ的N端和C端会组合成完整的β-半乳糖苷酶，添加X-gal和IPTG后会形成蓝斑（阴性克隆）。

如果外源基因插入到多克隆区（MSC）后，由于 外源基因破坏了LacZα的阅读框，导致LacZα（N端）不能和LacZ的C端组合成完整的β-半乳糖苷酶，所以形成白斑（阳性克林）。

蓝白斑筛选结果（图片来源于www.biotek.com.au）

以pGEM-T载体为例，LacZα上有MCS，可以插入外源基因。转化后，在Amp-X-gal-IPTG平板上，阳性克隆形成白斑，阴性克隆形成蓝斑。

pGEM-T载体图谱

蓝白斑筛选失败的几个常见原因：

（1）IPTG和X-gal储存液过期或反复冻融失效了。也可见于配制的平板保存时间太久导致失效，表现为整个平板全是白斑 ，因为β-半乳糖苷酶（LacZ）基因根本就没有表达（IPTG失效），或者根本没有底物存在（X-gal失效）。

（2）外源基因太短，在插入LacZ-α的MCS区后没有破坏LacZ-α的阅读框 ，导致阳性克隆也呈现蓝斑， 表现为整个平板全是蓝斑 。

（3）将X-α-gal当做X-gal来用了 。X-α-gal和X-gal命名很像，导致当做同种东西来用了，这种概率还是有的。X-α-gal是酵母的α-半乳糖苷酶的底物，X-gal是大肠杆菌的β-半乳糖苷酶的底物。如果平板上加的是X-α-gal，由于缺少底物，会导致 整个平板全是白斑 。

（4）转化的感受态不对，细菌里不含LacZ基因的C端 ，导致无论如何也没法组装出来完整的LacZ， 表现为整个平板全是白斑 。