平板划线法：原理、操作与应用

平板划线法：原理、操作与应用

平板划线法是微生物学领域中一种经典的分离和纯化微生物的技术。通过在固体培养基表面进行精确的划线操作，可以使样品中的微生物逐步稀释，最终在培养皿上形成独立的、遗传上一致的菌落。本文将详细介绍平板划线法的基本原理、操作步骤、不同类型的方法及其适用场景，并讨论该技术的优点与局限性。

什么是平板划线法？

"Streak" 本意是指“一条长而细的线”。划线平板法是一种微生物培养技术，其中样品以长而细的线条形式在固体培养基表面的平板上进行涂布。

平板划线法是一种微生物实验室技术，用于从混合菌群中分离出纯培养物，或者获得良好的、独立分布的细菌菌落。这种方法主要用于获取细菌的纯培养物，但也可以用来分离酵母菌。它是微生物学中最常用的无菌技术之一，用于隔离和增殖细菌，是一种机械性的分离技术，在微生物学中通常被称为“划线法”。

图1、平板划线法

平板划线法通过在琼脂培养基表面上连续稀释细菌，最终使得在最后一次划线的末端只有少数细菌细胞被接种，从而形成良好的、独立分布的菌落。因此，这种方法可以机械性地从混合菌群（无论是同一种或不同种）中分离出细菌。如果样品中只含有一种细菌，则在最后一次划线中可以看到同一类型的菌落；如果样品中含有多种细菌，则可能会看到不同类型的菌落。

这是一种古老的微生物学方法，自罗伯特·科赫时代起就开始使用。该方法最初由Loeffler和Gaffky在科赫的实验室中设计并使用，目的是在琼脂表面连续稀释细菌并获得良好的、独立分布的菌落。自此之后，它一直作为细菌学中的一个重要工具。

这是一种简单且可靠的无菌技术，使用诸如棉签、木制或塑料棒、金属棒、牙签或接种环等工具来稀释并在预灭菌的特定固体培养基表面上铺展样品。使用的样品可以是悬浮液或是琼脂表面的菌落。成功的划线可以获得良好的、独立分布的菌落，这有助于描述该生物体在特定培养基和条件下的菌落特征。

平板划线法的目的

1. 从混合培养物中获得细菌的纯培养物。
2. 获得良好的、独立分布的菌落。
3. 增殖细菌。

平板划线法的原理

平板划线法的基本原理是在固体培养基表面通过机械性铺展的方式对样本进行稀释，以达到在最后一次划线处获得良好、独立分布的菌落。

样本可以是固体培养基上的菌落或者是液体培养基中的悬浮液。通常使用无菌接种环或棉签等工具取样，并将其放置在一个干净的固体培养基表面的一端，然后制备成涂抹物。

接着，使用这些工具按照一定的模式在琼脂培养基表面连续划线。随着划线过程的进行，样本逐渐被稀释，直到细菌细胞被分隔开成为单个细胞或菌落形成单位（CFU），通常相隔几毫米。

当这些接种后的平板经过培养后，单个细菌或菌落形成单位会生长成为独立的菌落。这样就可以获得纯培养物，并能够描述该生物体的菌落形态。

平板划线法的分类

基于划线的方式，平板划线法可以分为以下几种类型：

1. 四象限划线法（Quadrant Streaking）

这是最常用的方法，将培养皿分成四个相等的部分依次划线。

每个相邻的部分依次接种，最后一个部分的接种物被稀释到能够形成单个菌落的程度。

通常采用不连续的划线方式，在每个部分之间火焰灼烧接种环进行消毒。

如果样本中的细菌量很少，也可以使用连续划线法而不必在每个部分之间消毒接种环。

这种方法一般只能用于单一样本。

2. T形划线法（T-Streaking）

将培养皿分为三个部分，并依次划线。

划线形状类似于字母“T”，最后部分接种物被稀释至形成单个菌落。

与四象限划线法类似，通常采用不连续划线法，但在稀释度很高的样本中也可使用连续划线法。

同样适用于单一样本。

3. 连续划线法（Continuous Streaking）

接种物以连续的方式从起点到培养皿中心均匀分布。

不需要将培养皿划分区域也不需要在划线过程中消毒接种环。

适用于已经高度稀释的样本或者仅需要纯化培养而非分离单个菌落的情况。

可以在一个培养皿的不同区域接种多个样本。

4. 放射状划线法（Radiant Streaking）

接种物首先在边缘划线，然后垂直划线并最终斜向交叉划线。

适合于纯化培养和稀释样本的接种。

5. 半定量划线法（Semi-quantitative Streaking）

常用于尿液培养。

使用校准的接种环（通常是1或2微升）来接种一定体积的液体样本。

样本以水平线的形式在培养皿中间划线，然后在整个培养皿上以连续来回运动的方式均匀分布。

这种方法可以在获得纯培养的同时大致估算活菌数量。

6. Z字形划线法（Zigzag Streaking）

这是一种连续划线法的变体，接种物以Z字形的模式在培养皿上连续划线。

通常用于纯化培养并大量培养。

这些方法各有特点，选择合适的方法取决于实验的目的以及样本的特点。

平板划线法的要求

平板划线法的要求包括以下几个方面：

1. 划线工具

划线工具是一种无菌工具，用于在培养基表面划线接种样本。常用的划线工具有棉签、接种环（金属或塑料）、牙签、木制或金属或塑料的棒/丝等。其中最常用的是接种环（镍铬合金丝制成）。

2. 样本

待接种的细菌样本可以是悬浮液、液体培养基或固体培养基上的菌落。使用接种环采集样本后将其转移到新鲜的培养基表面上进行划线。

3. 固体培养基

需要使用特定的固体培养基来进行细菌的分离和鉴别。这种培养基通常含有凝固剂（如琼脂），并在使用前已经固化。

4. 本生灯及其他实验室设施

本生灯用于对接种环进行灭菌，并且在火焰周围创建一个无菌区域。此外，还需要其他化学品、灭菌材料及实验室设备。

这些要求确保了平板划线法能够在无菌条件下进行，从而得到纯净的菌落以供进一步研究。

平板划线法的步骤

平板划线法的一般程序可以概括为：

1. 准备所有必需品，穿戴个人防护装备（PPE），对工作台面进行灭菌，并让所有样本和培养基恢复到室温（如果它们之前被冷藏过）。
2. 如果样本非常浓稠，可以先进行适当的稀释，这有助于获得独立的菌落（但这不是必须的，因为样本在划线过程中会被自然稀释）。
3. 通过火焰灭菌接种环，并让其冷却。取一小部分孤立的菌落（如果样本是悬浮液，则取一接种环的样本）。

图2、平板划线法的步骤

四象限划线法（Quadrant Streaking Procedure）

1. 将培养皿倾斜60度角握在手中（左撇子则使用右手）。
2. 使用接种环快速轻柔地来回移动，在培养皿的约四分之一区域从边缘向中心划线。
3. 对接种环重新火焰灭菌并冷却，将培养皿逆时针旋转90度，然后从第一象限的最后一组划线开始，在第二象限继续划线。
4. 重复步骤3，完成第三和第四象限的划线。
5. 在第四象限，可以采用分开的几条划线或者呈之字形尾迹的方式划线。
6. 可以选择在每次划完一个象限后灭菌接种环，也可以连续划线，但仅适用于样品非常稀释的情况。

T型划线法（T-Streaking Procedure）

1. 同样将培养皿倾斜60度角握在手中。
2. 使用接种环快速轻柔地来回移动，在培养皿的约三分之一区域从边缘向中心划线形成“T”字形状。
3. 对接种环重新火焰灭菌并冷却，将培养皿逆时针旋转90度，从第一区的最后一组划线开始，在第二区继续划线。
4. 重复步骤3，完成第三区的划线，可选择不同的划线模式。

连续划线法（Continuous Streaking Procedure）

1. 同样将培养皿倾斜60度角握在手中。
2. 从培养皿的一端开始，连续地划向中心，然后将培养皿旋转180度，无需再次灭菌接种环，继续在另一半培养皿上划线。

放射状划线法（Radiant Streaking Procedure）

1. 同样将培养皿倾斜60度角握在手中。
2. 使用接种环在培养皿边缘进行柔和的之字形划线。
3. 对接种环重新火焰灭菌并冷却，然后从最初划线的点开始，向培养皿的远端进行放射状划线。
4. 再次灭菌接种环并冷却，然后画出横线穿过放射状划线。

半定量划线法（Semi-Quantitative Streaking Procedure）

1. 同样将培养皿倾斜60度角握在手中。
2. 使用校准过的接种环取一定量的样本（如尿液）。
3. 在培养皿中央进行垂直或水平的初划线。
4. 使用同一接种环，通过来回的之字形运动，将菌液分散在初划线上。
5. 在培养皿底部边缘标记日期、姓名、样本编号等信息。
6. 将培养皿倒置，在合适的条件下培养（通常为37℃下培养24小时）。

平板划线法的结果解读

平板划线法的结果解读通常在培养期结束后进行（通常是在37°C下培养24小时）。培养结束后，观察最终划线区域是否存在独立的菌落，并记录这些独立菌落的形态特征。如果使用的培养基是指示剂类型（例如麦康凯琼脂中的乳糖发酵），还需要记录培养基的变化情况。

在平板的第一划线区域内，由于菌液浓度较高，通常会有密集且相互融合的菌落生长；随着划线区域的推进，菌落数量逐渐减少，直到在最后的划线区域内出现少数分布均匀的独立菌落。

纯培养中，预期所有菌落的外观都相似。如果样品中只含有一种细菌，则可以获得具有相同形态特征的菌落。但在混合培养的情况下，会得到不同形态特征的菌落。

当观察到不同类型的菌落时，需要对每种类型的菌落再次进行平板划线，以便获得每种细菌的纯培养。

需要注意的是，在某些情况下，两种或多种细菌的菌落特征可能非常相似，即使它们属于不同的物种，所有的菌落看起来也会很像。在这种情况下，需要通过其他实验方法来区分这些菌落。

平板划线法的注意事项

平板划线法的操作注意事项如下：

1. 培养基准备

使用前确保培养基已完全固化。

如果培养基曾冷藏，应使其回到室温再使用。

使用前检查培养基是否有水滴、污染或异物。

2. 安全措施

遵守适当的安全规程。

将所有未知或临床样本视为潜在危险物质，并采取相应的安全措施。

3. 使用工具

若使用牙签划线，应使用钝端，手持尖端并使其与培养基表面呈10至20度角。每划完一个象限后丢弃牙签，并使用新的牙签划下一个象限。

4. 样本处理

如果样本为悬浮液，划线前应充分混匀，并遵循无菌操作。

划线前后应用火焰灭菌试管或瓶子的边缘。

如果使用微量移液器，不要让移液管触碰试管或瓶子的内壁。

如果样本为菌落，应轻轻接触菌落，只需取一小部分即可。

5. 操作环境

在无菌区域操作（例如在本生灯火焰间或生物安全柜内）。

使用前后应对接种环进行适当灭菌。

若采用火焰灭菌，确保接种环冷却后再使用。

6. 选择合适的培养基

选择适当的培养基。

7. 样本量控制

只使用少量样本，过多的样本会导致无法形成独立的菌落。

8. 划线技巧

划线时动作要轻柔，不要施加过大的压力。

每划完一个象限后要灭菌接种环。

划线后逆时针旋转培养皿。

不要在前一个象限的前半部分继续划线。

9. 划线模式

遵循合适的划线模式。

如果在同一平板上划线多个样本，确保每个样本的划线区域之间至少有20至30毫米的距离。

10. 标记与培养

正确标记平板，并在适宜的条件下培养。

遵循上述注意事项可以确保平板划线法的成功执行，并保证结果的准确性和安全性。

平板划线法的应用

1. 从混合培养物中获得纯培养物：为了进行形态学、生化和分子测试以鉴定微生物及其应用。
2. 确定样本是否为单一或混合物种。
3. 研究细菌的菌落特征。
4. 产生遗传上相同的个体菌落。
5. 临床标本的接种：在诊断实验室中用于培养病原体的独立菌落。
6. 尿液培养：用于分离病原体并半定量尿路病原体以确定感染的重要性。为此目的使用校准的接种环。

平板划线法的优点

1. 简单可靠：易于操作，方便快捷。
2. 形成良好的独立菌落：每个菌落由遗传上相同的个体组成，便于后续测试和应用。
3. 同时进行稀释和接种：无需单独进行样本稀释。
4. 手动控制：可以灵活控制样本量和接种区域。
5. 灵活的选择：不同的划线模式可根据样本量、培养皿可用性等因素选择最合适的方法。
6. 适合需氧菌：对于需氧菌来说是一种有效且耗时较少的方法。
7. 适应性强：适用于来自液体培养基或固体培养基上的样本。

平板划线法的局限性

1. 定性方法：不能量化微生物的数量。
2. 更适合需氧菌：不太适合厌氧菌。
3. 无法纯化共生菌。
4. 不适合大量样本：如果样本量大且活菌计数非常高，则难以形成独立的菌落。
5. 需要特定的预固化培养基：需要事先了解样本中可能存在的微生物种类或准备不同类型的培养基。
6. 技术要求：若操作者不够熟练或培养基新鲜制备，划线时可能会撕裂琼脂表面。
7. 耗时：需要额外的工具（接种环）进行划线。
8. 易受污染：划线过程中需要打开培养皿盖并不断使用接种环，因此需要保持无菌环境并定期灭菌接种环。

总结

平板划线法是一种基本而又不可或缺的微生物学技术，用于从混合菌群中分离出纯培养物。通过在固体培养基表面上进行一系列精心设计的划线操作，可以有效地将样品中的微生物稀释到足以形成独立菌落的程度。这项技术不仅适用于细菌，还适用于酵母菌等微生物。虽然平板划线法存在一些局限性，比如难以量化微生物数量和不适合厌氧菌的培养，但它仍然是微生物实验室中进行分离、纯化和初步鉴定微生物的首选方法之一。掌握了这项技术，微生物学家就能够更好地研究和利用这些微生物在医学、工业和环境科学等多个领域的应用。