【菌周刊】毕赤酵母感受态制备及转化（超详细Protocol，建议收藏）

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【菌周刊】毕赤酵母感受态制备及转化（超详细Protocol，建议收藏）

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近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视。与大肠杆菌相比，酵母作为低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等固有优势。此外，其又可以完成对表达蛋白质的正确加工、修饰以及合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统在蛋白翻译后加工、修饰方面的不足。而在酵母中，又以毕赤酵母异军突起，兼具培养方便和经济的优势，应用最为广泛。

毕赤酵母目前有包含锂盐法、PEG 法、原生质体法和电转法在内的4种转化方法。锂盐法和 PEG 法方法简便，但效率很低，每微克 DNA 只有几十个转化子或更低。电转法转化率较高，且一般可得到高拷贝重组，其转化率都可达到 109~ 1010个转化子/μg 质粒 DNA。而原生质体法则由于其操作繁琐，故使用不多。

一、氯化锂转化法

由于DNA带负电荷，细菌的细胞膜也带负电荷，因此实现转化需要克服DNA和细胞膜间的电荷排斥作用。同时，DNA进入细胞需要细胞膜上有孔隙。而化学转化中常会使用Ca2+来结合DNA中的负电荷与细菌细胞膜中的电荷，克服了外来DNA和细菌细胞膜之间的负电荷排斥作用。Ca2+与DNA和细菌细胞膜脂多糖的磷酸盐形成配位络合物，Ca2+促进了DNA和脂多糖的结合。但要注意的是，醋酸锂对毕赤酵母无效，仅氯化锂有效；而PEG3350的加入可屏蔽高浓度氯化锂的毒害作用。化学感受态细胞转化的第二步是热激。热激使温度升高，细胞膜的脂质释放，在细胞膜上形成孔隙，DNA得以进入细菌内部。

感受态毕赤酵母制备

A.接种毕赤酵母到 50mL YPD培养基中，30℃过夜摇菌（约 24～28h）培养到OD值为 0.8～1.0（约 108 Cells/mL）；
B.收获细胞，用 25mL 无菌水洗涤一次，室温下 1500g 离心 10min；
C.重悬细胞于 1mL 100mM 氯化锂溶液中，将悬液转入 1.5mL EP管；
D.离心机最大速度离心 15s沉淀菌体，重悬菌体于 400μL 100mM 氯化锂溶液中；
E.按 50μL/管分装，立即进行转化。

毕赤酵母转化

A.煮沸 1mL 鲑鱼精 DNA 5min，迅速冰浴以制备单链单体 DNA；将感受态酵母菌离心，以去除残余的氯化锂溶液；
B.如表2 所示，严格按顺序加入所有组分，剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约 1min）；
C.30℃水浴孵育 30min，42℃水浴热休克 20～25min;
D.6000～8000rpm 离心收集酵母菌体；
E.重悬酵母于 1mL YPD 培养基，30℃摇床孵育；
F.1～4h 后，取 25～100μL 菌液铺选择性培养基平板，于 30℃培养 2～3天鉴定。

二、PEG1000 转化法

2.1感受态毕氏酵母制备

A.接种环接种毕赤酵母于 YPD 平板，30℃培养2天;
B.挑取单克隆酵母菌株于 10mL YPD 培养基中，30℃振荡培养过夜；
C.取步骤 2 中小量菌液接种到 100mL YPD 培养基中振荡培养，待其 OD 值从 0.1 升到 0.5～0.8；
D.室温下 3000g 离心收集酵母菌体，50mL 缓冲液 A 洗涤一次；
E.重悬菌体于 4mL 缓冲液 A 中，按 0.2mL/管分装于 1.5mL 的离心管中，每管加入 11μL DMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，-70℃保存。

2.2毕氏酵母转化

A.将约 50μg 线性化质粒 DNA 溶于 20μL Tris-EDTA buffer或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入单体 DNA以获得最大转化率；
B.37℃水浴孵育 5min，中间混合样品 1～2 次；
C.取出离心管，加入 1.5mL 缓冲液 B，彻底混匀，30℃水浴孵育 1h；
D.室温下 2000g 离心 10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于 1.5mL 缓冲液 C 中；
E.离心样品，去除上清液，将样品重悬于 0.2mL 缓冲液 C 中；
F.将所有转化液铺于选择性平板，于 30℃孵育 3～4 天后鉴定。

三、电转化法

电转化法可以利用瞬时电场增加细胞膜通透性，使DNA进入细胞内部的实验技术，广泛应用于感受态细胞的制备。

3.1感受态毕氏酵母制备

A.取 10μL菌液，接种于 200mL LB 液体培养基中活化培养，培养条件为37℃，200 rpm，16～18 h；
B.以4℃，4000 rpm，20 min的条件离心，得菌体沉淀，弃上清后，菌体用 10％甘油洗涤重悬，重复3 次；
C.第三次离心后，弃绝大部分上清，留下约 1mL 液体用于重悬菌体；
D.从制得的感受态细胞中，取 200μL 于灭菌 EP 管中，加入连接反应产物 5μL，混匀，不要产生气泡，在冰上放置 5min；
E.将混匀后的 200μL 菌液移入电击杯中。使用电击穿孔仪进行转化，设置为电压 2500 V，时间 5 ms；
F.电击后，往电击杯中加入 800μL SOC 培养基，冲洗出菌体，转移至灭菌1.5 mL EP 管中，随后在37℃，150 rpm条件下轻摇 45～60 min；
G.取全部均匀涂布于含 25 μg/mL Zeocin的 LB平板上，待涂布液不再流动时，于37℃条件下培养 12～16h。

3.2毕氏酵母转化

A.取新鲜制备的（或-70℃冻存的）感受态细胞置于冰浴中，使其完全解冻；
B.将 100μL 菌体移出至一新的无菌 EP管中，加入 5~20μg 线性化质粒（5～10μL），轻弹混匀，尽数吸出后转移到 0.2cm 型的电穿孔转化杯中；
C.转化杯置于冰浴中 5～10 分钟，保持低温；
D.电穿孔转化电击条件：电压—1500V，电阻—400Ω，电容—25μF，脉冲时间—10ms，一次电击。
E.电击后，马上在电击转化杯中加入 1mL 4℃预冷的浓度为1M的山梨醇溶液，用微量移液枪吹打均匀，置于冰浴中；
F.取 30℃烘至表面半干的 MD 培养基平板，在超净工作台上无菌操作涂布平板，400μL/板。