实验指南 | 放线菌与酵母菌的形态观察
实验指南 | 放线菌与酵母菌的形态观察
一、实验目的
- 利用显微镜观察辨认识别放线菌的营养菌丝、气生菌丝、孢子丝；观察不同种类放线菌孢子丝的形态。
- 掌握用染色方法区分酵母细胞的死活
- 染色观察酵母细胞中的液泡与肝粒糖。
二、实验原理
- 放线菌
放线菌基本结构主要包括基内菌丝、气生菌丝及孢子丝三类。
基内菌丝匍匐生长于培养基内，一般无隔膜，直径0.5~1μm，其功能为吸收营养和排泄废物，长度差别很大，有的可产生色素。
营养菌丝发育到一定阶段，伸向空间形成气生菌丝。直生或分枝丝状，较基内菌丝粗，在光学显微镜下观察颜色较深。
孢子丝是气生菌丝发育到一定阶段分化出的形成孢子的菌丝。
放线菌结构图
放线菌孢子丝的形态及其在气生菌丝上的排列方式，在不同放线菌种类间差异很大，是放线菌不同菌种鉴定的重要依据。孢子丝有直形、波浪形、钩状、螺旋状等多种不同形状，其中螺旋状的孢子丝最为常见，但其螺旋的松紧、大小、螺数和螺旋方向也会因菌种不同而不同。孢子丝的着生方式有对生、互生丛生与轮生(单轮生和双轮生)等多种。
常见放线菌的孢子丝形态及着生方式
- 酵母菌
酵母菌是圆形、椭圆形，不运动的单细胞微生物。其细胞核与细胞质已有明显的分化，菌体比细菌大。酵母菌繁殖方式比较复杂，无性繁殖主要是出芽生殖，仅裂殖酵母属是以分裂方式繁殖，有性繁殖是通过接合产生子孢子。
美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的。用美蓝对酵母的活细胞进行染色，由于活酵母细胞的新陈代谢作用，使其具有较强的还原能力，能使美蓝从蓝色的氧化型变为无色的还原型，所以染色完成一段时间后活的酵母菌细胞表现为无色。死细胞或代谢缓慢的老细胞则因它们无还原美蓝染料的能力或还原能力极弱，因此美蓝染色在一定时间后仍表现为蓝色或淡蓝色。所以，用美蓝染色酵母菌制作的水浸片不仅可观察酵母的形态及出芽生殖情况，还可以区分酵母细胞的死活。不过，实验过程中，美蓝染液的浓度、作用时间等均会影响细胞区分效果，应加以注意。
酵母菌形态结构及其出芽生殖
此外，中性红可将酵母细胞中的液泡染成红色，碘液可将细胞中的肝糖粒染成淡红色。
三、实验材料
实验材料
(1) 酵母菌、各组同学自己上次实验通过插片法和玻璃纸法完成的各类放线菌制片、土壤中分离纯化的不同放线菌菌落。
(2) 卢戈式碘液、0.1%吕氏碱性美蓝染液、中性红染液。
(3) 接种环、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子等。试剂配制
(1) 卢戈式碘液
碘化钾 2g
碘 1g
蒸馏水 300mL
先将碘化钾溶于少量蒸馏水中，待全溶解后再加碘，振荡溶解后稀释至300mL，保存在棕色玻璃瓶内。用时可将其稀释2~10倍，这样染色不致过深，效果更佳。
(2) 吕氏碱性美蓝染液。
A液: 美蓝(Methylene Blue) 0.6g
95%酒精 30ml
B液: KOH 0.01g
蒸馏水 100mL
分别配制A液和B液，配好后混合按要求稀释即可。
(3) 中性红染液。
先配成1%中性红水溶液(1g中性红溶于100mL蒸馏水中)。取这种溶液1mL用0.6%生理盐水(或蒸馏水)稀释至50mL，储存于棕色瓶中，放于黑暗处保存。
四、实验步骤
- 放线菌制片--印片法
(1) 印片。
在放线菌培养平板上划一小块菌苔置于载玻片上，菌面朝上，用另一片载玻片轻轻在菌苔表面按压，使孢子丝及气生菌丝附在载玻片上。
(2) 固定。
将有印迹一面朝上，通过火焰2~3次固定。
(3) 染色。
石炭酸复红染色1min，水洗，自然干燥。
(4) 镜检。
用油镜观察孢子丝形态特征。
放线菌观察--插片法
用镊子小心取出上次实验插片法培养放线菌的盖玻片，擦去背面附着物，然后将有菌的一面向上置于载玻片上，分别用低、中、高倍镜观察，也可滴加少量0.1%的吕氏碱性美蓝染液染色观察。放线菌观察--玻璃纸法
在载玻片中央滴一小滴水，用镊子从平板上取下上次实验接种放线菌的玻璃纸片，菌面朝上放在水滴上，使其紧贴在载玻片上，勿留气泡，再用低倍镜和高倍镜镜检观察。酵母的形态观察
(1) 美蓝浸片的观察。
① 用接种环取少量酵母菌与0.1%吕氏碱性美蓝染色液混合均匀，放置2~3min后，加盖玻片，先用低倍镜后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况并用颜色区别死活细胞。
② 染色15min后再次观察，注意死细胞是否增加。
(2) 中性红染色。
① 用接种环取少量酵母菌与中性红染色液混合均匀，放置约5min后，加盖玻片，观察。
② 细胞无色，液泡呈红色。
(3) 肝糖粒观察。
① 用接种环取少量酵母菌与碘液混合均匀，放置约1min后，加盖玻片观察。
② 细胞内贮藏物质肝糖粒呈红色。
五、实验结果
绘制你看到的各种放线菌、酵母菌的形态结构