Science最新研究：PIEZO通道在肠道干细胞中的关键作用
Science最新研究：PIEZO通道在肠道干细胞中的关键作用
肠道干细胞（ISCs）在维持肠道健康中发挥着关键作用。近期，《Science》杂志发表了一项重要研究，揭示了PIEZO通道在ISC感知周围基质微环境硬度和拉伸变化中的关键作用。
PIEZO通道对ISC干细胞标志物和数量的维持发挥重要作用
研究人员首先分析了从小鼠结肠中利用FACS分离的纯化细胞群RNA测序(RNA-seq)结果，发现Piezo1在所有包括干细胞的上皮细胞类型中表达，而Piezo2仅在肠细胞和肠内分泌细胞中表达，并通过单分子荧光原位杂交(smFISH)染色证实：大多数肠隐窝细胞中高度表达Piezo1，而Piezo2表达较低。在蛋白质水平上，检测到Piezo1主要表达在绒毛顶部以及隐窝细胞中。研究人员随后使用特定抑制剂在含有ISC的3D类器官中阻断了PIEZO通道的激活，实时成像显示PIEZO抑制会损害类器官的生长并减少每个类器官中新生隐窝的数量；同时，ISC干细胞标志物（Lgr5、Olfm4和Axin2）的表达下降。因此，PIEZO通道是维持ISC数量所必需的。
PIEZO通道是肠道干细胞自我更新和维持且分化为分泌谱系所必需的
为了在体内检验PIEZO在肠道稳态中的作用，研究人员构建并发现在肠上皮细胞中两种PIEZO通道均缺失的双敲除小鼠（PiezodbKO）会出现腹泻、便血和体重迅速下降，最终导致死亡。同时，PiezodbKO小鼠肠道的组织学分析显示隐窝更长、绒毛更短，出现隐窝增生及异位上皮细胞增殖，同时还出现OLFM4+ISC耗竭及Lgr5表达显著下降。为了进一步分析ISC的功能，研究人员从对照和PiezodbKO小鼠中分离出肠隐窝并将其培养成3D类器官，发现PIEZO敲除小鼠的纯化隐窝不能形成3D类器官结构，进一步通过细胞周期检测及评估凋亡水平，作者推测ISC损失可能是由自我更新和/或分化缺陷而不是细胞死亡或细胞周期进程缺陷引起的。随后研究人员在肠隐窝类器官形成后经4-羟基他莫昔芬(4’OHT)处理实现PIEZO敲除并在传代后对类器官进行分析，发现仅经过一次传代培养，PIEZO敲除的类器官就表现出隐窝形成显著减少，出现严重的自我更新缺陷。此外还发现尽管吸收细胞仍然存在，但PiezodbKO小鼠的分泌细胞数量显著减少，PIEZO通道的缺失导致潘氏细胞（一种位于小肠隐窝中的高度分化的分泌上皮细胞）完全丧失。因此，PIEZO通道是肠道干细胞分化为分泌谱系所必需的。
PIEZO机械转导通过抑制NOTCH信号通路和激活WNT信号通路调节肠道干细胞生物学特性
由于NOTCH信号能够通过激活Hes1促进隐窝增殖并通过抑制Atoh1抑制ISC向分泌谱系分化，这与PiezodbKO小鼠的表型具有相似性。为了评估NOTCH信号的变化，研究人员通过scRNA-seq分析发现PIEZO缺失后Hes1总体表达水平增加了1.4倍，特别是在吸收祖细胞群簇0中增加了两倍；Atoh1表达则显著下降。进一步用PIEZO抑制剂GsMTx4处理Hes1-GFP类器官，发现GFP信号显著增加，证实PIEZO抑制了NOTCH信号的激活。而对于负责干细胞增殖和维持的WNT信号通路，scRNA-seq数据分析表明在PIEZO缺失的肠隐窝细胞中β-catenin表达阳性的细胞百分比下降。进一步使用慢病毒转导，生成WNT信号报告基因7TG(7x-Tcf-eGFP)类器官系，并用PIEZO抑制剂GsMTx4处理后发现，GFP信号显著减少，说明WNT信号通路活性下降。此外，用PIEZO激动剂Yoda1过度激活PIEZO并不会影响NOTCH或WNT信号的活性，也不会影响类器官生长和隐窝形成，这表明基础PIEZO活性足以调节下游通路和细胞命运选择。研究人员进一步假设在PIEZO缺失的情况下，恢复NOTCH和WNT通路水平可以挽救ISC的功能，因此在PIEZO敲除的肠道类器官培养过程中使用了NOTCH抑制剂（DAPT）和/或WNT3配体，结果发现NOTCH抑制和WNT激活的组合可以恢复类器官的生长。因此，PIEZO通道是协调干细胞增殖、自我更新和下游通过NOTCH和WNT通路实现分化所必需的。
PIEZO通道更容易被隐窝底部生态位中刚性更硬的基质激活
除了下游信号机制外，研究人员还试图确定激活肠道干细胞中PIEZO通道的上游刺激。为了测试ISC是否通过PIEZO感知其生态位的基质硬度，研究人员将小鼠的3D隐窝类器官接种在不同硬度的PAA凝胶上生成2D单层体外模型，并使用Yoda1诱导PIEZO激活，通过钙瞬变分析发现PIEZO介导的ISC内Ca2+水平增加与刚度成正比，在18kPa条件下培养的单层细胞中的瞬变比在1.5kPa条件下培养的单层细胞中瞬变更高，表明PIEZO在坚硬的基质上更容易被激活。因此，它对ISC维持的调节贡献可能取决于生态位硬度。为了验证这一假设，在硬度不断增加的凝胶上培养了膜表达tdTomato的单层细胞并使用PIEZO抑制剂GsMTx4抑制或使用激动剂Yoda1激活PIEZO通道，发现干细胞区室随硬度的增加而缩小。在柔软基质（1.5至5kPa）上，用Yoda1激活PIEZO可增大ISC面积，而同时抑制PIEZO则无效果，这表明PIEZO活性在低刚性基质上已经很小，无法进一步抑制。相比之下，在较硬基质（11至30kPa）上激活PIEZO时，ISC面积没有变化；而抑制PIEZO则显著缩小了干细胞区室。这些结果表明，肠隐窝底部的ISC可能经历更硬的环境，从而允许PIEZO激活。为了在体内验证这一点，研究人员使用原子力显微镜(AFM)在速冻肠组织切片上测量了肠隐窝底部和顶部基底膜周围的硬度，发现隐窝底部基底膜区域的平均弹性高于顶部的弹性，表明ISC所处的环境相较于隐窝顶部的细胞更硬。因此，PIEZO通道更容易被坚硬的基质（如隐窝底部）激活，并且是ISC功能中硬度依赖性变化的正确响应所必需的。
PIEZO通道可以通过响应组织张力来调节肠道干细胞的功能
另一种潜在的PIEZO激活剂是组织张力。小肠绒毛底部承受张力，张力向绒毛尖端消散；此外，隐窝内的张力向干细胞区（隐窝中心）方向增大，在过渡区减小。因此，研究人员假设ISC通过PIEZO感知张力的变化从而诱导细胞命运决定。为了验证这一点，他们设计了一种细胞拉伸装置，通过使用牵引电机施加单轴拉伸来调节单层细胞中的张力。鉴于PIEZO通道在软基质上不易激活，他们将单层细胞置于5kPa的凝胶上并施加连续循环拉伸，发现对单层细胞施加外源拉伸力可以使OLFM4+干细胞面积增加三倍，且在拉伸时使用GsMTx4抑制PIEZO会降低OLFM4+干细胞的面积，但不会达到未拉伸对照组水平的程度，这意味着ISC对微环境的机械感应可能涉及一种额外的、不依赖于PIEZO的机制。值得注意的是，拉伸不会引起顶端干细胞面积的变化，但会增加EdU+细胞的数量，这表明干细胞扩增不是因为细胞大小增加而是通过增殖实现的。因此，ISC通过PIEZO机械敏感通道传递微环境的机械变化，根据干细胞生态位的生物力学特性来调节其细胞命运。
这项研究结合生物工程和类器官培养等技术，提出了一个全面的用于研究肠道干细胞生态位的PIEZO机械感应综合模型，并通过寻找上游微环境中的机械刺激因素和下游胞内调节的相关信号通路，验证了PIEZO通道在肠道干细胞自我更新、增殖和分化一系列过程中维持肠道稳态的重要协调作用，表明PIEZO通道可通过感知基质硬度和组织拉伸的变化从而控制干细胞行为，帮助维持肠道功能，并为今后进一步研究其在衰老、修复或慢性炎症等病理环境中的潜在作用奠定了基础。
本文原文来自《Science》