噬菌体展示和其他肽展示技术

噬菌体展示和其他肽展示技术

噬菌体展示技术是一种基于噬菌体DNA基因修饰的分子技术，通过将肽/蛋白质/抗体片段与噬菌体外壳蛋白结合，使其在噬菌体表面表达。这项技术自1980年代后期发展以来，已经在生物制药领域取得了重大突破，成功开发出多种商业化药物。本文将详细介绍噬菌体展示技术的原理、应用及其在生物制药领域的重大贡献。

自100多年前发现噬菌体以来，它们在基础和应用生命科学中得到了深入开发。这一发现后不久，一项新的试验启动了，对细菌感染患者施用噬菌体，但由于成功率参差不齐和缺乏噬菌体生物学知识，这种方法引起了很多争议。此外，由于抗生素治疗的普及，大多数研究人员对在噬菌体疗法的背景下研究噬菌体失去了兴趣。随着1970年代后期基因工程的到来，基于噬菌体的载体成为早期的克隆载体之一。

在1980年代后期，密苏里大学的生物学家George P. Smith提出了一个肽连接到噬菌体外壳的外部蛋白质，从而实现了表面显示。1985年，他和他的同事引入了“噬菌体展示”一词，它表示外来分子（通常是肽）在丝状噬菌体表面的展示/展示。描述了将编码57聚体肽的DNA序列插入丝状噬菌体基因III中，以在外壳蛋白III（pIII） 内产生与外部肽序列的融合蛋白。嵌合蛋白以“免疫可及的形式”呈现在噬菌体表面，从而可以保留该病毒的传染性。1988年，Parmley和Smith通过将外部DNA序列的克隆位点重新定位到编码pIII蛋白的基因的另一部分，从而获得了完全功能性的外壳蛋白III，从而获得了完全功能性的外壳蛋白III。这种升级对于通过从数十亿个克隆的文库中进行“靶噬菌体的亲和纯化”（称为“生物淘选”）进行噬菌体增殖是必要的，与主要程序相比，这显着降低了抗体需求。同年，全噬菌体颗粒首次被用于诱导针对显示的外部肽的免疫反应。在1990年代，Winter及其同事在丝状噬菌体上实现了人类抗体片段的展示，例如单链可变片段（scFv）。从那时起，噬菌体展示已成为一种分子强大的工具，通过在噬菌体表面呈现具有特异性的片段，从大量变体（文库）中选择具有特异性结合特性的肽/抗体片段，从而产生针对特定靶标的分子探针。为了表彰这些进步，George P. Smith与Gregory P. Winter爵士分享了诺贝尔奖，“以表彰其肽和抗体的噬菌体展示”。事实上，他们彻底改变了化学和生物制药的发展，并为新的抗体发现、表位定位和亲和力选择奠定了基础。自噬菌体展示文库建立以来，已经有更多的应用可用，此类文库可以包括编码抗体的序列、包含cDNA（互补DNA）、随机寡核苷酸，甚至酶编码DNA片段。丝状噬菌体功能显示的蛋白质/肽的例子包括碱性磷酸酶（60 kDa）、芥末胰蛋白酶抑制剂（7 kDa）、Src同源物3（6.5 kDa） 和细胞色素b562（11 kDa）。cDNA文库的功能展示是通过与蛋白质pIII、pVI或Fos亮氨酸拉链（稍后描述）的C端融合来实现的。2012年，初始噬菌体展示选择的分子阿达木单抗（肿瘤坏死因子结合剂）被美国食品和药物管理局批准用于治疗人类疾病。噬菌体展示技术使生产源自抗体的前六种商业化药物成为可能，其他几种基于人类抗体和抗体片段的药物正在开发中。

成功使用任何方法都需要充分了解其原理、优点和缺点。因此，我们的目标是从其原理的介绍开始描述噬菌体展示技术。然后，我们将更详细地讨论各种系统，介绍它们的优缺点。

噬菌体展示是一种基于噬菌体DNA基因修饰的分子技术，以便通过将肽/蛋白质/抗体片段与噬菌体外壳蛋白之一结合来使肽/蛋白质/抗体片段在噬菌体表面表达。将感兴趣的外源DNA序列引入噬菌体基因组核苷酸序列中的特定位置，该序列编码一种噬菌体外壳蛋白（图D）。当噬菌体感染发生时，噬菌体基因表达开始在细菌宿主内部，插入的肽/抗体片段随后作为编码外壳蛋白和克隆序列的相关基因的组合产物显示在噬菌体表面。因此，如果克隆的序列是随机的，噬菌体展示文库，提供>1010变体，可以同时构建并作为DNA克隆长期储存，而不需要单独构建各种肽或抗体片段以及随后表达、纯化和分析每个特定构建体。噬菌体展示技术的力量还在于它能够在展示的分子（表型）和编码展示分子（基因型）的DNA序列之间形成物理连接。这种表型-基因型连锁支持特定克隆的选择，并允许通过对噬菌体基因组中某些插入片段进行DNA测序来即时确定特定结合剂（肽或蛋白质）的氨基酸序列。

图1 M13噬菌体病毒粒子的结构及原理的噬菌体展示技术。

Ff噬菌体（构成丝状噬菌体家族的一部分）是一组细长的病毒，能够感染带有F质粒的革兰氏阴性菌，例如大肠杆菌。它们属于Inoviridae家族和Inovirus属。在噬菌体展示方面，包括噬菌体M13、fd和f1的Ff组是整个丝状噬菌体家族中最重要的。这些杆状噬菌体在某些蛋白质类型的数量方面具有最简单的衣壳。噬菌体展示技术中使用的最流行的丝状噬菌体是噬菌体M13，主要是因为它能够将外源DNA的长片段适应其基因组。

Ff组具有单链 （ss）DNA基因组，在不同菌株之间具有98%的相似性，因此，它非常适合基因工程目的。M13环状6.4 kb ssDNA基因组 （图2）密封在直径为6.5 nm且长度为930 nm的蛋白质圆柱体中。有趣的是，插入高达12 kb的外源DNA（几乎是野生型噬菌体基因组长度的两倍）不会影响Ff噬菌体的功能。Ff噬菌体的基因组由11个基因组成，这些基因根据相应基因编码的蛋白质的以下功能分为几组：（i） 衣壳蛋白，包括pIII、pVI、pVII、pVIII和pIX，（ii） 称为pII、pV和pX的DNA复制蛋白，以及 （iii） 组装蛋白，包括pI、pIV和pXI（图2）.两种次要外壳蛋白pIII和pVI位于细长噬菌体病毒粒子的一端，另一端，还有另外两种次要外壳蛋白pVII和pIX。噬菌体衣壳由主要衣壳蛋白pVIII组成，该蛋白从基因组周围的数千个拷贝聚合而来。

图2 M13基因组组织。

如前所述，第一个噬菌体展示系统是使用丝状噬菌体开发的。尽管随后构建了许多其他显示系统（基于不同的噬菌体、各种细菌、酵母和哺乳动物细胞，以及无细胞的），但基于Ff噬菌体的系统仍然是数量最多且使用最多的系统。这是由于噬菌体结构的简单性，易于使用噬菌体DNA进行遗传作，以及噬菌体在细菌细胞中的高繁殖效率，从而有可能在短时间内获得大量的病毒粒子。

丝状噬菌体展示的工作原理依赖于克隆DNA片段，这些片段将数十亿种版本的某些配体编码到噬菌体基因组中，与编码一种噬菌体外壳蛋白的基因相连。在噬菌体表面显示外来分子的关键外壳蛋白是pIII（406个氨基酸残基）和pVIII（50个氨基酸残基）。

pIII蛋白以3到5个拷贝出现在噬菌体的尖端，它由三个不同的结构域组成（Omidfar和Daneshpour，2015）（图3D）。N1结构域解释了病毒DNA在感染过程中开始易位到大肠杆菌中，而N2结构域通过将噬菌体蛋白pIII连接到雄性大肠杆菌的菌毛上来提供宿主细胞识别。展示的蛋白质或肽的呈递发生在pIII的N端，但展示的分子被pIII的N端残基的间隔区（接头肽）分离。C端结构域负责pIII整合到噬菌体外壳中，是衣壳结构的组成部分。pIII蛋白的展示导致在噬菌体尖端产生一个包含每种特定肽3-5个拷贝的文库。相对较大的分子，多达38个氨基酸，可以掺入pIII蛋白的N端，而不会失去任何噬菌体感染性。事实上，在所有丝状噬菌体外壳蛋白中，只有pIII大到足以向B细胞和T细胞呈递几个表位。

图3. M13噬菌体pIII蛋白的结构

综上所述，两种主要的外壳蛋白适用于不同类型分子的展示：pVIII非常适合肽和小蛋白的展示，但它是大肽展示的无效平台;pIII蛋白尽管拷贝数低，但可以有效地用于显示大肽或蛋白质。使用两种主要衣壳蛋白之一作为分子呈递平台的主要区别在于显示化合价：附着在pIII上的肽/抗体片段可以显示每个病毒粒子最多5个拷贝，而显示在pVIII蛋白上允许在单个噬菌体颗粒上呈现数百个（88型-稍后描述）或数千个肽/抗体片段拷贝（8型-稍后描述）。对于高亲和力抗体分离等实验，使用pIII融合是最合适的，因为首选降低的化合价。另一方面，抗体-pVIII融合导致高亲和力选择，但可能是低亲和力结合。除了两种主要的外壳蛋白外，还检测了所有其他丝状噬菌体外壳蛋白的外源肽或小蛋白的呈递，尤其是蛋白质pVI、pVII和pIX。然而，次要外壳蛋白pIII和主要外壳蛋白pVIII是迄今为止使用最广泛的。

参考文献：
Jaroszewicz, W., Morcinek-Orłowska, J., Pierzynowska, K., Gaffke, L., & Węgrzyn, G. (2022). Phage display and other peptide display technologies. FEMS microbiology reviews, 46(2), fuab052. https://doi.org/10.1093/femsre/fuab052