PCR、qPCR和RT-PCR的特点、操作步骤及常见问题的原因

PCR、qPCR和RT-PCR的特点、操作步骤及常见问题的原因

PCR（聚合酶链式反应）作为分子生物学的超级工具，有着多种变体。本文将深入探讨各类PCR的区别及实验操作步骤，帮助读者全面了解PCR技术。

各类PCR，分不清？

PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，反应体系中加入dNTP、Mg2+等原料，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程，可快速特异性地在体外扩增目的DNA。

知识链接

• Ct值（Cycle threshold，循环阈值），是指qPCR反应中荧光信号达到设定阈值时对应的循环数（一般Ct值在20-30之间）。
• 扩增曲线（Amplification curve）是指随PCR反应进行，根据荧光信号强度随着循环数变化而绘制的曲线。正常的扩增曲线（S型）包括四个阶段：基线期、指数增长期、线性增长期、平台期。
• 熔解曲线（Dissociation curve）是指随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。
• 扩增子（Amplicon）为DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列。比如通过PCR扩增得到的某个基因的扩增片段。更简单地说，扩增子是经过人工扩增的DNA片段或RNA片段的扩增产物。

PCR在基础科学研究（如基因功能分析、基因检测）、医学诊断（如病原体检测和遗传病筛查）、法医鉴定（如身份鉴定）以及环境监测（如生物多样性研究）等具有广泛的应用，是现在生物技术和遗传研究的核心工具。

当然，各类PCR实验除了在特点、应用、优缺等有诸多不同之外，其实验操作也是有区别滴~接下来就和小M一起来看下它们的操作步骤吧！

常规PCR

PCR的基本成分包括模板DNA、引物、反应缓冲液、游离核苷酸、聚合酶、盐和水（不含核酸酶和污染DNA）等。只要目标区域两侧的碱基序列（寻找的特定DNA序列）是已知的，几乎任何DNA区域都可以作为PCR扩增的模板。

在典型的PCR分析中，通过重复简单的三步过程：变性、退火和延伸，目标区域即可完成扩增（图1）。

图1. PCR反应流程图

基本步骤：

1. 准备反应体系：模板DNA、引物（正、反向）、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、PCR反应缓冲液（提供合适的pH和离子强度）、耐高温TaqDNA聚合酶、去离子水等。也可直接使用PCR Mix。
2. PCR扩增：设置PCR扩增程序（包含变性、退火、延伸、循环、彻底延伸）。
3. 检测：通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

实时荧光定量PCR（qPCR）

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）是DNA的实时PCR扩增，通过荧光探针测量，最常见的是插入染料或基于水解的探针，从而实现PCR产物的定量（见图2）。该技术常用于检测病原体的存在和确定感兴趣的DNA序列的拷贝数。

图2. qPCR流程图

同样要经过多个扩增循环，其中模板DNA最初变性，然后是针对特定序列的寡核苷酸引物的退火，随后通过耐热DNA聚合酶从每个退火引物延伸互补链，导致扩增子数量在PCR期间呈指数增长，扩增子数量的增加是在PCR过程中通过荧光报告基因检测“实时”记录的。

基本步骤：

1. 准备反应体系：模板DNA或经过逆转录得到的cDNA、引物（正、反向）、荧光染料（如SYBR Green）或探针（如Taqman探针、qPCR探针等）、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、PCR反应缓冲液（提供合适的pH和离子强度）、耐高温TaqDNA聚合酶或专用的荧光PCR聚合酶、去离子水等。也可直接使用qPCR Kit。
2. PCR扩增：同常规PCR，并设置荧光检测步骤。
3. 荧光检测：通过荧光探针或染料实时监测荧光信号。
4. 数据分析：根据Ct值和标准曲线，计算样本中的目标DNA或RNA浓度。

常用两种报告系统：插入式SYBR Green测定法和TaqMan探针系统。

SYBR Green

• SYBR Green通过插入相邻碱基对与所有双链DNA结合，发出荧光信号（图3A）。
• 在未结合状态下，SYBR Green不发出荧光。因此，在每个周期中，通过荧光的相应增加来测量模板扩增。

TaqMans探针

• 退火过程中，TaqMan探针和引物与模板结合。当TaqMan探针完好无损时，能量在猝灭器和报告器之间传递，因此，没有检测到荧光信号。
• 当Taq聚合酶合成新链时，该酶的5’外切酶活性会切割带有标记的探针上的5’核苷酸，从而使报告分子从探针上释放出来。一旦它不再靠近，来自探针的荧光信号被检测到，并通过荧光的相应增加记录模板扩增（图3B）。

图3. 染料法和探针法qPCR原理流程图

逆转录PCR（RT-PCR）

逆转录PCR（Reverse transcription PCR, RT-PCR）可使用RNA作为模板生成互补DNA（cDNA）。利用逆转录酶，产生cDNA的单链拷贝。然后，这可以通过DNA聚合酶扩增，产生双链cDNA，进入基于PCR的标准扩增过程（图4A）。

该技术可用于目标基因（GOIs）的分子克隆，其可研究用抑制剂、兴奋剂、小干扰RNA（siRNA）或敲除模型等处理模型系统后基因表达的变化。这项技术也经常用于检测RNA-Seq实验之前（作为质量控制）和之后（确认变化）的表达变化。

基本步骤：

1. 准备反应体系：提取RNA，加入逆转录酶（常用的逆转录酶有M-MLV逆转录酶和AMV逆转录酶）、引物（通常使用随机引物，oligo (dT)引物或基因特异性引物）、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、反转录缓冲液（提供合适的pH和离子强度）、RNase抑制剂（防止RNA在反应过程中降解）、去离子水等。也可直接使用RT-PCR Kit。
2. 逆转录：设置逆转录程序。
3. PCR扩增：以合成的cDNA为模板进行PCR或qPCR实验。（RT-qPCR分一步法RT-qPCR和两步法RT-qPCR两种）。
4. 产物分析：通过琼脂糖凝胶电泳（RT-PCR）或荧光信号（RT-qPCR）分析扩增效果。

此外，一种将RT-PCR与qPCR相结合的技术，逆转录定量实时PCR（Reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR）。通过在qPCR反应中使用cDNA来测量RNA水平，从而可以快速检测基因表达变化（图4B）。

图4. RT-PCR和RT-qPCR流程图

（A）RT-PCR工作流程。分离RNA，通过逆转录（RT）生成cDNA；然后进行PCR以扩增感兴趣的区域。（B）RT-qPCR程序。在开始qPCR程序之前，分离RNA并生成cDNA。

注：RNA质量至关重要！！！OD260/280=1.9-2.1的RNA才"优秀"。

此外，选择合适的内参（或内标）是非常重要的，这关系到实验结果的准确性和可靠性。小M为大家整理了qPCR常用的内参基因参考，需要的小伙伴可关注收藏喔~

选择策略Tips：根据实验样本类型进行预实验测试候选内参基因在目标样本中表达的稳定性确定合适的内参基因。

数字PCR（dPCR）

数字PCR（Digital PCR, dPCR）是目前可用的另一种强大技术，在临床诊断中有着广泛的应用。其中，dPCR方法用于液体活检中的癌症监测和器官移植排斥监测等应用，这两种方法都基于检测患者样本中低丰度的无细胞DNA。

dPCR技术的原理（图5）涉及将具有制备的PCR溶液的样本分离成大量分区（通常为纳升大小的液滴），其中单独进行PCR反应。每个分区包含零个、一个或几个目标DNA副本，遵循泊松分布（Poisson distribution）。

图5. 数字PCR（digital PCR, dPCR）原理图

在荧光探针存在下进行等位基因特异性PCR反应后，通过荧光检测含有扩增目标序列的分区。每个分区单独进行荧光扫描，根据目标DNA的副本是否存在，读数为“1”或“0”。阳性分区占总数的比例可以确定样本中目标序列的浓度。

基本步骤：

1. 样本准备：模板DNA或通过逆转录反应得到的cDNA，调整至合适浓度用于后续分配过程。
2. 反应体系准备：模板DNA或cDNA、引物（正、反向）、荧光染料（常用SYBR Green）或探针（如Taqman探针、qPCR探针等）、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、PCR反应缓冲液（提供合适的pH和离子强度）、耐高温TaqDNA聚合酶或专用的数字PCR聚合酶、去离子水等。
3. 反应体系分配：将反应混合液分为多个微反应单元。
4. PCR扩增：设置PCR扩增程序，每个微反应单元独立进行PCR扩增反应（包含变性、退火、延伸、循环、彻底延伸）。
5. 数据分析：检测阳性反应单元数量并定量分析样本中目标DNA或RNA的浓度。

注意事项：

• 设置合适的阴性对照和阳性对照可确保实验结果的可靠性。
• 数字PCR一般需要比常规PCR更多的循环次数，因为在有的微反应单元中的模板可能经过几次循环之后才开始扩增反应。高次数循环反应能保证只要孔中有模板，每个PCR孔中都能产生几乎相等的PCR产物。

小结

PCR技术是分子生物学研究的利器，了解掌握各类PCR的特点、操作步骤及常见问题的原因，有助于提高实验成功率，为科研提供可靠数据支持。希望这篇整理对你有所帮助！如果有更多问题或经验分享，欢迎在评论区留言，我们一起探讨学习！

参考文献：

[1] Mullis KB, et al. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-50.

[2] Saiki RK, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732):1350-4.

[3] Garcia JG, et al. Polymerase chain reaction: a landmark in the history of gene technology. Crit Care Med. 2005 Dec;33(12 Suppl):S429-32.

[4] Taylor SC, et al. The Ultimate qPCR Experiment: Producing Publication Quality, Reproducible Data the First Time. Trends Biotechnol. 2019 Jul;37(7):761-774.

[5] Bustin S, et al. Talking the talk, but not walking the walk: RT-qPCR as a paradigm for the lack of reproducibility in molecular research. Eur J Clin Invest. 2017 Oct;47(10):756-774.

[6] Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol. 2000 Oct;25(2):169-93.

[7] Sanders R, et al. Improving the standardization of mRNA measurement by RT-qPCR. Biomol Detect Quantif. 2018 Mar 16;15:13-17.

[8] Coudray-Meunier C, et al. A comparative study of digital RT-PCR and RT-qPCR for quantification of Hepatitis A virus and Norovirus in lettuce and water samples. Int J Food Microbiol. 2015 May 18;201:17-26.

[9] Fraisse A, et al. Digital RT-PCR method for hepatitis A virus and norovirus quantification in soft berries. Int J Food Microbiol. 2017 Feb 21;243:36-45.

[10] Analytical Methods, et al. PCR - the polymerase chain reaction. Anal Methods. 2013 Dec 19;6(2):333-336.

[11] Grace Adams. A beginner’s guide to RT-PCR, qPCR and RT-qPCR. Biochem (Lond) 22 June 2020; 42 (3): 48–53.

[12] Smith CJ, et al. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 2009 Jan;67(1):6-20.

[13] Nogués N. Recent advances in non-invasive fetal HPA-1a typing. Transfus Apher Sci. 2020 Feb;59(1):102708.