免疫组化实验指南：从固定到显色的关键细节解析

免疫组化实验指南：从固定到显色的关键细节解析

免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种基于抗原与抗体特异性结合原理的实验技术，通过化学反应使结合抗体的显色剂显色来确定组织或细胞内的抗原，对其进行定位、定性及相对定量的研究。作为生命科学研究中常用且重要的实验方法，免疫组化的实验步骤虽然看似简单，但要获得高质量的结果，关键在于对实验细节的把控。

标本固定：不仅仅是“切一切”和“泡一泡”

1. 温柔取材：取材时应避免挤压组织，轻柔操作，尽量避开坏死区域。实质组织取材厚度应小于5mm，以利于均匀一致的固定。
2. 新鲜的固定液：固定液通常使用10%中性缓冲福尔马林(NBF)，需新鲜配置。商用型固定液应注意其有效期，避免使用过期变质的固定液。
3. 充分及时地固定：固定液与组织的体积比最好大于等于20倍，取材后应立即固定。固定时需将瓶口封住，避免甲醛挥发。组织的固定时间一般为12-24小时。

修复大法：不仅仅是“煮一煮”

抗原修复是免疫组化实验中的关键步骤，常见的修复方法包括微波炉修复、水浴锅修复和高压锅修复。不同修复方法对信号强度的影响不同：

• 微波炉修复简单易行，效果良好，但并非所有抗体都适用。
• 使用柠檬酸修复后，切片需浸泡在修复液中自然冷却；而用EDTA修复后，切片可直接进行下一步操作。

注：通过在柠檬酸盐缓冲液(左)、EDTA 缓冲液(中)中煮沸，或经胃蛋白酶 (右)消化，抗原修复后，利用EGF Receptor (D38B1) XP® Rabbit mAb #4267 和EGFR mouse mAb 对石蜡包埋人类肺部肿瘤进行IHC分析。对于#4267，经EDTA缓冲液修复的信号强度更强。然而，对于竞争者的EGFR mouse mAb，只有经胃蛋白酶消化后才可获得信号。

对的抗体，对的使用：不仅仅是“买买买和加加加”

选择合适的抗体是获得高质量免疫组化结果的关键：

1. 种属和应用范围：确保所选抗体适用于所需种属的石蜡切片。
2. 稀释液和稀释比：严格按照抗体说明书推荐的稀释液和稀释比进行操作。不同抗体可能需要不同的稀释条件，例如SignalStain® 抗体稀释液和TBST/5% NGS。

匹配的二抗和显色系统：“配一配和滴一滴”

1. 二抗选择：使用多聚HRP（Poly-HRP）的二抗可以放大信号。
2. 显色系统：配合优质的色原产品，如SignalStain® DAB Substrate Kit，可以提升灵敏度和增强信号。

注：DAB色原比较：在人乳腺癌组织中使用p-Stat3(Tyr705)(D3A7)XP® Rabbit mAb#9145检测p-Stat3的表达，使用不同的产品进行显色。与竞争者的DAB产生的信号相比，SignalStain® DABSubstrateKit的显色强度更佳。

常见问题及解决方案

无染色或染色弱

1. 样本存放：建议使用新鲜制备的切片，如果需要储存，请将其置于4°C，储存时间取决于靶标。
2. 组织切片干片：实验过程中需要保持切片有液体覆盖。
3. 切片制备：脱蜡不彻底会导致斑点出现和不均匀的背景染色，建议使用新的二甲苯重新制备切片。
4. 抗原修复：推荐使用微波炉进行修复，避免使用热水浴。
5. 抗体稀释比例及稀释液：严格按照产品说明书操作，必要时需要摸索最佳使用量。
6. 孵育时间：CST的免疫组化一抗推荐4°C孵育过夜。
7. 检测系统：推荐使用聚合物二抗检测系统，如SignalStain® Boost IHC Detection Reagents。

高背景

1. 切片制备：脱蜡不彻底会导致背景染色不均匀，需要重新制备切片。
2. 淬灭过氧化物酶：使用3% H2O2淬灭内源性过氧化物酶。
3. 生物素封闭：对于富含生物素的样本，使用聚合物类检测系统并进行生物素封闭。
4. 封闭：使用恰当的封闭液进行封闭。
5. 抗体稀释比例及稀释液：严格按照产品说明书操作。
6. 二抗交叉反应：检测与二抗来源种属一样的样本时，可能会产生高背景，需要通过对照实验确认。
7. 清洗：充分清洗对于降低背景非常重要，每次孵育后需清洗3次，每次5分钟。

免疫组化实验的成功关键在于对实验细节的严格把控。通过优化固定、修复、抗体选择和显色等关键步骤，可以显著提高实验结果的准确性和可靠性。希望本文提供的技术细节和解决方案能帮助研究人员更好地掌握免疫组化实验技术，获得高质量的实验结果。