氧化苦参碱联合黄芪甲苷调节免疫：实现低毒高效抗三阴性乳腺癌

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@小白创作中心

氧化苦参碱联合黄芪甲苷调节免疫：实现低毒高效抗三阴性乳腺癌

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https://bydrug.pharmcube.com/news/detail/5d7d315e2f842f1fd78a3f1a67cd3623

乳腺癌是全球女性发病率最高的恶性肿瘤，临床放化疗可能会导致严重的副作用，而手术切除则有很高的复发率，因此要达到最佳治疗效果非常具有挑战性。三阴性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）是侵袭性最强的乳腺癌亚型，虽然目前肿瘤免疫疗法是临床上治疗肿瘤很有前景的方法，但是，由于TNBC中存在免疫抑制微环境，靶向PD 1/PD-L1抑制剂对其疗效有限，而且，TNBC缺乏有效的药物治疗特异性靶点。因此，治疗TNBC迫切需要创新的治疗策略。

前期研究发现，氧化苦参碱(Oxymatrine, Om)可通过调控上皮-间质转化过程和纤维化相关蛋白的积累，从而抑制癌症相关成纤维细胞（Cancer associated fibroblasts, CAFs）的活化，减少肿瘤间质增殖；黄芪甲苷(Astragaloside IV，As)具有潜在的增强肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes，TILs）抗肿瘤活性的作用，然而，Om和As对TNBC的潜在联合作用及其机制仍不确定。

日前，一篇发表在《International Immunopharmacology》杂志，名为“Combination of oxymatrine (Om) and astragaloside IV (As) enhances the infiltration and function of TILs in triple-negative breast cancer (TNBC)”的论文探讨了氧化苦参碱（Om）和黄芪甲苷Ⅳ（As）联用可增强TNBC中TILs的浸润和功能。

Om在体外抑制CAFs活化并增强T细胞浸润

经5 ng/mL TGF-β1处理NIH3T3细胞，建立CAFs的细胞模型，观察Om对CAFs的影响。结果显示，Om对CAFs增殖呈剂量依赖性的抑制作用（图2A）；对CAFs 关键细胞标志物α-SMA在NIH3T3中的表达升高呈抑制作用（图2B-C）。此外，较低浓度的Om能明显减少TGF-β1在NIH3T3细胞中的FAP表达（图2D）。进一步通过流式细胞术检测发现，在没有Om的情况下，T细胞穿过成纤维细胞迁移到下腔的能力明显增强，表明Om的处理能使CAFs失活（图2E-F）。

As增强T细胞的功能活性

利用Transwell小室建立CTLL - 2细胞与4T1细胞的共培养体系，评估As对T细胞线粒体功能的影响。TEM图像显示，共培养条件下CTLL - 2中线粒体形态不规则，线粒体内嵴数量减少，表明T细胞中线粒体受损。经As处理后，线粒体体积和线粒体内嵴数量显著增加。

此外，在As处理组中，可观察到线粒体融合，表明受损的线粒体有改善(图3A-C)。进一步地，通过线粒体压力测试，评估CTLL - 2在不同处理条件下的呼吸能力(图3D )。共培养体系下CTLL- 2的基础OCR明显降低，而As处理后CTLL - 2的基础OCR显著增加，并呈剂量依赖性(图3E )。通过FCCP测定线粒体解偶联后的最大呼吸，在共培养组中细胞OCR显著降低，而在As组中趋势相反（图3F）。ELISA结果显示，经As处理后，T细胞中IFN -γ的释放增加(图3G )。不同浓度的As处理可增加与4T1共培养的CTLL - 2细胞中Granzyme B 的表达(图3H )。As处理CTLL - 2细胞后，4T1细胞的凋亡率增加(图3I - L)。这些结果表明，As可通过调节线粒体活性增强TILs的肿瘤杀伤能力。

Om与As联用对体外CAFs和T细胞的影响

首先利用CAFs和CTLL-2细胞模型筛选出Om-As的最佳比例。结果显示，Om-As与TGF-β1的比例为2:1时，可抑制TGF-β1诱导的NIH3T3细胞的增殖（图4A），而显著促进CTLL-2细胞的增殖（图4B）。Trans-CAFs迁移实验结果显示，Om-As（2:1）可显著增加与单层CAFs共培养下室中CTLL-2细胞的数量（图4C）。同时，细胞凋亡分析证实，与经Om-As（2:1）处理的CTLL-2共培养的4 T1细胞凋亡率增加（图4D-G）。

Om-As体内抗乳腺癌药效研究

通过将4 T1-luc细胞接种到小鼠的乳腺脂肪垫内建立原位乳腺癌模型，注射48h后，将小鼠分为不同剂量的Om-As处理组，以评估Om-As的抗肿瘤功效（图5A）。给药后第10天，处死小鼠提取肿瘤组织并称重，与对照组相比，Om-As组的抗肿瘤效果呈上升趋势（图4B）。与生理盐水组(图4D - H)相比，Om - As治疗组的肿瘤重量、肿瘤体积和肿瘤指数均显著降低。H & E染色显示，Om-As治疗后肿瘤细胞核面积明显缩小，肿瘤组织大面积坏死（图6A）。与所有治疗组相比，未治疗组的Ki67增殖标记蛋白表达量较高（图6B）。TUNEL荧光检测证实，Om-As组诱导了大量肿瘤细胞凋亡，这与肿瘤抑制率数据一致（图6C）。上述结果表明，Om和As联合治疗不仅取得了显著的抗肿瘤效果，且无明显的不良反应。

Om-As改善TILs瘤内浸润

为探究Om - As抗TNBC机制，收集了4T1 - luc肿瘤组织进行流式分析。结果显示，与生理盐水组相比，Om-As（低剂量和高剂量）组均不同程度地增加了CD4+T和CD8+T细胞的数量（图7A-F）。此外，Om-As组高剂量组显著提高了CD4/CD8比值（图7G-H），改善了肿瘤免疫抑制微环境。

Om-As可抑制CAFs并改善体内TILs的功能

共聚焦免疫荧光显示，生理盐水组α-SMA蛋白表达量显著增加，表明肿瘤内CAFs大量存在，而瘤内CD8 + T细胞浸润程度较低。经Om-As处理后，α-SMA表达减少，瘤内CD8 + T细胞浸润增强（图8A）。Masson染色表明Om-As处理可减少CAFs的胶原沉积，从而抑制其活化（图8B）。与生理盐水组相比，Om-As增加了肿瘤内IFN-γ和Granzyme B的表达（图8C-D）。总体而言，Om - As通过抑制CAFs增加TILs的浸润，增强其抗TNBC作用。