为了排除假阳性结果，需要设置哪些对照实验，对照实验的酵母细胞应如何构建和处理？

为了排除假阳性结果，需要设置哪些对照实验，对照实验的酵母细胞应如何构建和处理？

在进行RIP-qPCR实验时，为了确保结果的准确性和可靠性，需要设置多种对照实验来排除假阳性结果。以下是几种常见的对照实验及其酵母细胞的构建和处理方法：

阴性对照

抗体阴性对照

• 构建：选用与实验目的蛋白无关的非特异性抗体，如正常小鼠 IgG 或兔 IgG 等，这些抗体不应与酵母细胞内的任何蛋白发生特异性结合。
• 处理：在酵母细胞裂解后，将非特异性抗体加入到细胞裂解液中，后续处理步骤与使用特异性抗体的实验组完全相同，包括免疫沉淀、洗涤、RNA 提取及 qPCR 分析等过程。

无抗体对照

• 构建：不使用任何抗体，直接进行后续实验操作。
• 处理：对酵母细胞进行裂解等操作后，直接加入磁珠进行孵育，后续同样进行免疫沉淀、洗涤、RNA 提取及 qPCR 等步骤，以检测是否存在非特异性的 RNA 与磁珠或其他实验成分结合的情况。

阳性对照

已知相互作用对照

• 构建：选择已知在酵母细胞中能与特定 RNA 结合的蛋白及对应的 RNA 作为阳性对照体系。例如，若研究 mRNA 的加工过程，可选用已知的参与 mRNA 剪接的蛋白及其作用的 mRNA 作为阳性对照。
• 处理：将表达已知相互作用蛋白的基因通过质粒转化等方法导入酵母细胞，使其在酵母细胞中正常表达。然后按照与实验组相同的实验流程进行操作，包括细胞裂解、免疫沉淀、RNA 提取和 qPCR 分析等，以验证实验体系的有效性。

内源性阳性对照

• 构建：利用酵母细胞内源性的、稳定表达且已知有明确 RNA 结合功能的蛋白及相应 RNA 作为阳性对照。比如酵母细胞中的某些核糖体蛋白与 rRNA 的结合是已知且稳定存在的，可以选择此类蛋白和 rRNA 作为内源性阳性对照。
• 处理：无需额外导入基因，直接使用正常培养的酵母细胞，按照实验流程进行操作，观察阳性对照的结果是否符合预期，以此判断实验体系是否正常工作。

背景对照

Input 对照

• 构建：取一部分未经免疫沉淀的酵母细胞裂解液作为 Input 对照，它包含了细胞内所有的 RNA 和蛋白等成分，代表了细胞内 RNA 的总体水平。
• 处理：将酵母细胞裂解后，取适量裂解液保存，其余裂解液用于免疫沉淀实验。对保存的 Input 裂解液进行与免疫沉淀后样品相同的 RNA 提取和 qPCR 分析步骤，以便与免疫沉淀后的样品进行对比，了解免疫沉淀的效率和特异性。

Mock 对照

• 构建：对酵母细胞进行与实验组相同的培养和处理，但不进行免疫沉淀步骤，直接进行 RNA 提取等后续操作。
• 处理：将酵母细胞培养至合适的生长阶段，然后进行细胞裂解等操作，但不加入抗体和磁珠进行免疫沉淀，而是直接从裂解液中提取 RNA，再进行 qPCR 分析，用于检测在没有免疫沉淀过程时，是否存在非特异性的 RNA 富集或干扰因素。