大肠杆菌发酵概述：生产过程、优缺点及发酵影响因素
大肠杆菌发酵概述：生产过程、优缺点及发酵影响因素
大肠杆菌作为最早且最经济的蛋白质生产方式，尽管随着基因工程技术的发展，表达系统已经扩展到真核系统如酵母、昆虫细胞、植物和哺乳动物细胞，但大肠杆菌表达系统依然因其独特的优势而保持着广泛的应用，在分子生物学和生物技术研究中依旧占据着举足轻重的地位。据统计，超过30%的重组蛋白质药物和50%重组蛋白质的制备是使用大肠杆菌作为表达宿主。
图1：大肠杆菌重组蛋白表达系统的应用
一、大肠杆菌的生产过程
1、菌种准备与保藏
首先，从基因库或实验室保存的菌种中，筛选出符合生产需求的大肠杆菌菌株，并通过PCR、测序等方法进行鉴定，确保其遗传特性稳定。其次，将冷冻保存的菌种在适宜条件下复苏，通过划线分离或液体培养等方法进行纯化，以获得单一菌落。最后，将纯化后的菌种在低温条件下进行长期保藏，以备后续使用。
2、培养基配制与灭菌
培养基是大肠杆菌生长和表达外源蛋白的基础，其成分和配比直接影响发酵效果。培养基通常包含碳源、氮源、无机盐、维生素等营养物质。配制完成后，需要进行高压蒸汽灭菌，以消除杂菌污染。
3、种子培养与扩大培养
将保藏的菌种接种到种子培养基中，经过一段时间的培养，获得大量活菌。然后将种子液按一定比例接种到发酵罐中，进行扩大培养。这个过程需要严格控制温度、pH值、溶解氧等参数，以保证菌体的生长和外源蛋白的表达。
4、发酵过程控制
发酵过程是大肠杆菌表达外源蛋白的关键环节。在这个过程中，需要实时监测并控制各种参数，如温度、pH值、溶解氧、搅拌速度等，以维持最佳的发酵条件。同时，还需要添加诱导剂（如IPTG）来启动外源基因的表达。
5、产物分离纯化
发酵结束后，需要对发酵液进行离心、过滤等预处理，去除大部分菌体和杂质。然后采用层析、超滤、沉淀等方法，对目标蛋白进行分离和纯化。这个过程需要根据目标蛋白的性质选择合适的纯化策略，以获得高纯度的产品。
二、大肠杆菌发酵的优缺点
优点
- 成本低：大肠杆菌生长快，培养条件简单，发酵周期短，生产成本相对较低。
- 表达量高：大肠杆菌能够高效表达外源蛋白，产量通常较高。
- 操作简便：发酵工艺成熟，易于放大生产，适合工业化应用。
- 遗传工具丰富：大肠杆菌的遗传背景研究充分，有丰富的基因操作工具和载体系统。
缺点
- 蛋白质折叠问题：大肠杆菌缺乏完善的蛋白质折叠和修饰系统，可能导致目标蛋白形成包涵体，影响其生物活性。
- 毒性问题：某些外源蛋白可能对大肠杆菌有毒性，影响其生长和表达效率。
- 分泌能力有限：大肠杆菌分泌外源蛋白的能力较弱，多数情况下需要在胞内表达，增加了产物分离的难度。
- 安全性问题：大肠杆菌是革兰氏阴性菌，其细胞壁中含有内毒素（LPS），在某些应用中可能引起免疫反应。
三、发酵影响因素
- 培养条件：温度、pH值、溶解氧等环境因素对大肠杆菌的生长和表达有重要影响。
- 培养基成分：碳源、氮源等营养物质的种类和浓度会影响菌体的生长和外源蛋白的表达。
- 诱导条件：诱导剂的种类、浓度和添加时机对目标蛋白的表达水平有显著影响。
- 菌株特性：不同菌株的遗传背景和生理特性会影响其表达效率和产物质量。
- 发酵规模：从实验室规模到工业规模的放大过程中，发酵条件和参数可能需要调整。
大肠杆菌发酵技术在不断发展和完善中，通过优化发酵工艺、改进表达系统和开发新型载体，可以进一步提高其应用效果和范围。随着合成生物学和系统生物学的发展，大肠杆菌作为模式生物和生产平台的重要性将进一步凸显。