冷冻电镜、透射电镜以及扫描电子显微镜对比
冷冻电镜、透射电镜以及扫描电子显微镜对比
冷冻电镜、透射电镜和扫描电子显微镜是三种重要的显微镜技术，它们在生命科学、材料科学等领域有着广泛的应用。本文将详细介绍这三种显微镜的技术原理、使用流程、优势及应用场景，并对它们进行对比分析。
透射电镜&冷冻电镜
1、透射电镜
透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）是利用高能电子束充当照明光源而进行放大成像的大型显微分析设备。1933年，德国科学家卢斯卡（Ruska）和克诺尔（Knoll）研制出了世界上第一台透射电镜，并在1939年由西门子公司以这台电镜为样机，量产了第一批商品透射电镜，分辨能力比光学显微镜提高了20倍。从此，人类对微观世界的科学研究有了更强有力的武器。到今天，透射电镜已经诞生了70多年，由电镜应用而形成的交叉性学科——电子显微学已经日趋完善，电镜的分辨能力也比最初时提高了超过100倍，达到了亚埃级，并且在自然科学研究中起到日益重要的作用，其结构如下图所示。
图. 透射电镜基本构造示意图
（1）成像原理：TEM的成像原理与光学显微镜类似，但使用电子束代替光束，并通过磁透镜进行聚焦成像。
（2）分辨率：传统透射电镜的分辨率极高，可以达到0.1至0.2纳米，使其能够观察到小于0.2微米的超微结构，又称为“亚显微结构”。
（3）样品制备：样品需要被制备成非常薄的切片，通常厚度为50至100纳米，以便电子束能够透过样品。
（4）操作流程：
- 样品制备：包括固定、脱水、包埋、超薄切片和染色等步骤。
- 装载样品：将制备好的样品装载到TEM的样品杆上，并插入到样品室内。
- 抽真空：开启真空系统，确保样品室内达到高真空状态，以避免电子束与气体分子的碰撞。
- 加高压：启动高压电源，为电子枪提供加速电压，一般生物样品观察使用60KV或80KV。
- 观察与成像：通过调整物镜、中间镜和投影镜等，观察样品并获取图像。
（5）应用领域：TEM广泛应用于材料科学、生物学、医学和纳米技术等领域，用于观察细胞结构、纳米颗粒、晶体缺陷等。
2、透射电镜和冷冻电镜之间的比较
冷冻电镜（Cryo-EM）与传统透射电镜（TEM）在多个方面存在显著差异，其比较如下表所示：
特征 | 透射电镜（TEM） | 冷冻电镜（Cryo-EM） |
|---|---|---|
成像原理 | 使用电子束透过样品，通过磁透镜聚焦成像 | 使用电子束透过冷冻样品，通过磁透镜聚焦成像 |
样品制备 | 需要将样品制备成超薄切片 | 可以保持样品在接近自然状态下的结构 |
分辨率 | 0.1-0.2纳米 | 0.2-0.3纳米 |
应用领域 | 材料科学、生物学、医学等 | 生物大分子结构解析、细胞结构研究等 |
优点 | 分辨率高，适合观察超微结构 | 可以保持样品的自然状态，适合生物大分子研究 |
缺点 | 样品制备复杂，可能破坏样品结构 | 分辨率略低于TEM，数据处理复杂 |
扫描电子显微镜&冷冻电镜
1、扫描电子显微镜
扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscope，SEM）是一种新型的电子光学仪器，主要用于观察样品的表面形态和结构，它在上世纪 60 年代迅速发展起来，是位于透射电子显微镜和光学显微镜之间得显微镜。
（1）成像原理
SEM的成像原理和光学显微镜、透射电子显微镜不同，它是以电子束作为照明源，把聚焦得很细的电子束以光栅状扫描方式照射到试样上，通过电子与试样相互作用产生的二次电子、背散射电子等，然后加以收集和处理从而获得微观形貌放大像，如下图所示。
图. 扫描电子显微镜的成像原理图2
（2）技术特点
- 具有高分辨率，现代扫描电镜的二次电子成像分辨率可达3～4nm；
- 放大倍数范围广，可以从几倍到200,000倍，且连续可调；
- 非接触观察，不会破坏样品形状和结构 ；
- 具有较大的景深和立体感，适合观察表面起伏较大的样品 。
（3）应用领域：
- 材料学：观察材料微观结构，分析成分和表面形貌，对新材料研发和材料性能改进具有重要意义；
- 生命科学：研究细胞和组织结构、微生物形态等；
- 纳米技术：高分辨率和高灵敏度使其成为研究纳米领域的重要工具；
- 能源领域：广泛应用于太阳能电池、燃料电池等研究，帮助观察微观结构中的缺陷或不均匀性 ；
（4）样品制备：与透射电镜相比，扫描电镜的样品制备相对简单，样品可以是导电的也可以是不导电的，通常需要喷镀一层导电膜，如金、铂或碳，以提高信号质量和避免电荷积累 。
（5）成像模式：主要包括二次电子成像和背散射电子成像。二次电子成像对样品表面形貌非常敏感，适合观察表面细节；背散射电子成像则能够显示原子序数衬度，用于成分分析。
（6）附加功能：许多扫描电镜配备有能谱仪（EDS）等附件，可以进行元素的定性和定量分析，提供材料的化学成分信息。
2、扫描电镜和冷冻电镜之间的比较
特征 | 扫描电镜（SEM） | 冷冻电镜（Cryo-EM） |
|---|---|---|
成像原理 | 电子束扫描样品表面，收集二次电子成像 | 电子束透过冷冻样品，通过磁透镜聚焦成像 |
样品制备 | 样品制备相对简单，可喷镀导电膜 | 需要将样品快速冷冻，保持自然状态 |
分辨率 | 3-4纳米 | 0.2-0.3纳米 |
应用领域 | 表面形貌观察、材料科学等 | 生物大分子结构解析、细胞结构研究等 |
优点 | 样品制备简单，适合表面形貌观察 | 可以保持样品的自然状态，适合生物大分子研究 |
缺点 | 分辨率低于TEM和Cryo-EM | 数据处理复杂，需要高精度冷冻技术 |
小结
上文中提到多种显微镜，下表分别用一句话帮助大家快速区分不同显微镜：
显微镜类型 | 特点 |
|---|---|
透射电镜（TEM） | 通过电子束穿透样品成像，分辨率极高，需要超薄切片 |
冷冻电镜（Cryo-EM） | 通过电子束穿透冷冻样品成像，保持样品自然状态，分辨率略低 |
扫描电镜（SEM） | 通过电子束扫描样品表面成像，分辨率较高，样品制备简单 |
资料来源：
[1] 资料来源：滨州医学院，医药研究中心发文，透射电子显微镜原理、结构及基本操作 (bzmc.edu.cn)
[2] 资料来源：中国科学院新疆生态与地理研究所《扫描电镜工作原理》