化学法、细胞法、皮肤模型：化妆品抗氧化功效评价指南

化学法、细胞法、皮肤模型：化妆品抗氧化功效评价指南

氧化应激是导致皮肤衰老和皮肤病发生的重要因素，而抗氧化成分能够有效清除自由基，提高抗氧化酶活性，从而延缓皮肤老化。对于化妆品行业来说，如何准确评估产品的抗氧化功效是一个重要课题。本文将介绍三种主要的体外抗氧化评价方法：化学法、细胞法和皮肤模型法。

化学法

化学法是通过加入氧化物与易氧化底物发生反应形成氧化产物，然后加入抗氧化剂检测其自由基清除能力。常见的自由基清除试验包括DPPH法、氧自由基吸收能力实验(ORAC法)、羟自由基清除能力测定、超氧阴离子自由基清除能力测定、还原能力测定、总抗氧化能力测试(ABTS法)等。

• DPPH法：DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）结构上有一个孤对电子，其甲醇或乙醇溶液呈深紫色，并在515~520nm范围有最大吸收峰。当有自由基清除剂存在时孤对电子被配对，DPPH自由基被还原成黄色DPPH-H非自由基形式。DPPH法具有稳定性好、灵敏度高、操作简单等优点。

• ORAC法：利用天然蛋白β-藻红蛋白在540nm的光谱照射下可发射565nm的荧光，当含有氧化剂或者自由基时，β-红蛋白的荧光则逐渐减弱的原理。

• 羟自由基清除能力测定：利用Fe2+和H2O2混合反应生成羟自由基(·OH)，加入水杨酸捕捉·OH并产生有色物质，该物质在510nm处有最大吸收。

• 超氧阴离子自由基清除能力测定：利用邻苯三酚会在碱性条件自氧化释放，生成有色中间产物，自由基清除剂可清除(O2-·)，阻止有色产物的积累。

• 还原能力测定：利用铁氰化钾能被还原剂还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾同三氯化铁反应生成普鲁士蓝，在波长700nm处比色，吸光度值越大说明还原能力越强。

• ABTS法：利用显色剂ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS+，在波长405nm测定ABTS的吸光度可得出样品的总抗氧化能力。

化学法相对简单、成本低、可实现大量样本的快速筛检，因此得到比较广泛的应用。缺点是标准化程度不高，至今没有建立统一的化学法，检测结果与体内实际应用效果存在差异；反应体系单一，方法脱离生物体，没有考虑到生物体的生理活性和代谢问题。

细胞法

细胞法是利用细胞培养技术模拟人体生理环境，选用皮肤相关细胞为对象，检测经氧化应激诱导后抗氧化物质清除ROS的能力。关于诱导方式的选择，可根据研究目选择紫外线、臭氧或H2O2。关于细胞的选择，目前文献报道较多的是角质细胞和成纤维细胞。

• HaCaT细胞：永生化角质细胞，保留了表皮全层的分化能力，最大程度上接近正常人的角质细胞，且其培养方法相对简单，可不限次数传代，分化能力稳定。

• 成纤维细胞：主要存在结缔组织中，主要作用是合成、分泌胶原蛋白和弹性蛋白，形成各种纤维。

细胞法可以对氧化损伤进行分子水平的研究，易操作，测试周期短，适用于原料、化合物和可溶性配方的筛检。但细胞呈平面生长无法构建出一个真实立体的微环境，不能反映化妆品的透皮性和人体皮肤整体的代谢状况。

皮肤模型

皮肤模型是利用组织工程技术，将人源皮肤细胞培养于特殊的插入式培养皿上构建而成，其在基因表达、组织结构、代谢活力等方面高度模拟人体皮肤。基于替代、减少和优化动物实验的3R原则，近年来越来越多国家加入禁止化妆品动物实验的行列，而人类皮肤模型的应用能够有效地替代动物实验。

商业化皮肤模型包括EpiSkin、EpiDerm和SkinEthic等，这些模型已通过ECVAM(欧洲替代方法验证中心)验证，可作为皮肤腐蚀性检测的动物替代方法。国内也有相关产品，如陕西博溪生物科技有限公司的EpiKutis表皮模型、北京富龙康泰生物技术有限公司的FP-3D全层皮肤模型。

皮肤模型的优点是适用于疏水性物质或固体、混合物或配方产品等不同理化性质的受试物；试验条件可控，数据易于定量并具有较好的重复性；试验周期较短；适用于原料、配方和成品的检测。缺点是作为单一的组织模型，无法测试组织和其他器官、生物系统的相互作用；相对于真皮的可暴露时间较短，不能有效检测长时间多次的日常使用功效；皮肤屏障功能弱于真实皮肤，受试物经皮吸收率较高；我国皮肤模型供应商有限，价格较高，难以大规模试验应用等。