单细胞转录组与流式细胞术强强联合：解析细胞复杂性的新维度
单细胞转录组与流式细胞术强强联合：解析细胞复杂性的新维度
随着生物医学研究的快速发展，单细胞测序与流式细胞术分别在解析基因表达和细胞群体鉴定方面发挥着重要作用。单细胞测序在揭示细胞异质性方面独具优势，但缺乏对细胞表面标志物的解析能力。流式细胞术则能对细胞表型进行多参数分析，但无法深入探讨基因表达动态。流式细胞术与单细胞转录组技术的结合，能够高效分离和富集特定细胞群体，并在蛋白质层面验证基因表达，为全面解析细胞复杂性与多样性提供了一种多维度的解决方案。
本篇推送将详细介绍单细胞测序与流式细胞术的技术原理，以及两者的联合研究背景。通过分析相关文献案例，帮助相关科研工作者深入理解单细胞转录组与流式细胞术联合在生物医学研究中的实际应用价值。
单细胞转录组与流式细胞术的联合研究
流式细胞分选技术能够根据细胞大小、颗粒度、细胞表面标志物以及细胞内多种生物标志物的差异，实现对稀有或特定细胞的高纯度分离和富集。这种多参数分析的分选策略，为单细胞转录组测序提供了高度特化的细胞样本，使得测序结果更加具有针对性和生物学意义。
另外，利用流式细胞术来针对单细胞转录组测序所获取的结果予以验证，可以全方位对细胞表面以及细胞内蛋白质的表达水平进行评估，进而在蛋白质层面实现对单细胞转录组测序结果的有效验证。
流式细胞术与单细胞转录组技术的联合应用，为细胞生物学研究提供了一种多维度、多层次的解决方案。这种技术融合不仅丰富了单细胞研究的深度，也扩展了其应用范围，使得研究者能够从细胞群体的宏观特性深入到单个细胞的微观世界，全面解析细胞的复杂性和多样性。
应用及研究方向
1. 提高样本制备合格率
运用分选技术，通过增加死活染料对死细胞及碎片进行染色，能够有效地从混合细胞群体中去除失去活性的细胞，分选后的活细胞率可提升至90%以上，这一步骤对于提升样本的整体质量至关重要。死细胞的去除不仅减少了可能的污染源，还避免了它们在数据分析中的干扰，从而确保了样本纯净度和实验结果的可靠性。
在单细胞测序实验中，这些经过流式分选处理的细胞，不仅提高了样本的质量也大幅增加了实验的成功率，为单细胞测序实验提供高质量的样本。
常见易产生碎片/死细胞的样本类型
单细胞实验中提升细胞活率的常见方法，请根据样本的实际情况选择最优的去死细胞方案。
a. 磁珠法：
- 成本较低，实验操作步骤简单，适合细胞量充足的样本，处理后的细胞活率可达80%以上，整体操作较温和，对细胞损伤较小
b. 流式分选：
- 可以实时查看分选情况，及时调整分选策略
- 高通量的特性尤其适合百万级以上的细胞量分选，处理后的细胞纯度可达90%以上
c. 低速离心+细胞筛过滤:
- 成本最低，对细胞损伤最小
2. 高度特化/富集特定细胞亚群
利用FACS技术，能够针对特定细胞亚群进行精确分离，并对那些在细胞群体中数量占比低的细胞类型进行有效富集。通过荧光标记的特异性抗体进行识别和分选。再采用单细胞转录组测序技术对这些分离的细胞进行基因表达水平的定量分析，这一连贯的实验流程可以显著提升获取目标细胞亚群转录组数据的精确度，确保了研究结果的可靠性并实现对生物学意义的深度挖掘。
2.1 常见的流式分选特化方案（部分展示）
2.2 文献案例
- 影响因子：45.5
- 样本设计：分别对8周龄C57BL6/J小鼠的11个组织中的内皮细胞进行分选分析，包括比目鱼肌、趾长伸肌（EDL）、心脏、小肠、结肠、肾脏、肺脏、脾脏、肝脏、睾丸和脑。每种组织的细胞来自8只小鼠，共使用30只小鼠。
- 研究路线：
- 相关图：
流式主要用于富集小鼠不同组织中的内皮细胞，使用CD45-PE-Cy7 (clone 30-F11 )、CD31-FITC (clone 390) 两种抗体分选出CD45-CD31+细胞，并对分选出的内皮细胞进行单细胞测序，探究组织内的ECs在单细胞水平上的异质性表现。 - 结论：作者通过流式分选和单细胞测序技术分析了小鼠11个不同组织内的内皮细胞，收集得到超过32000个单细胞转录组数据集，鉴定出78个内皮细胞亚群，揭示了不同组织中内皮细胞的相似性以及异质性。
3. 蛋白质表达与活性的验证
通过单细胞转录组测序技术获得的生物信息学分析结果，我们能够精准识别并挑选出具有研究价值的特定细胞亚群。并进一步应用流式细胞术的多色流式分析技术，对这些细胞亚群的表面及细胞内蛋白质表达水平进行全面精细的评估。这一过程实现了在蛋白质层面对单细胞转录组测序结果的有效验证，确保了从基因表达到蛋白质层面的生物学信息的一致性和可靠性。此外，该方式还可能识别出潜在的生物标志物，这些标志物的鉴定对于理解细胞病理过程、发现新的治疗靶点具有重要意义。
3.1 常见的流式蛋白表达/活性验证方案（部分展示）
3.2 文献案例
- 影响因子：45.5
- 样本设计：来自16名患者的骨髓组织，12个用于单细胞测序，12个样本用于CODEX，有8个重叠样本。
- 研究路线：
- 相关图：
在本文中，对53417个造血细胞和29325个非造血细胞进行3’转录组测序，鉴定出了三系造血和造血干细胞以及祖细胞亚群，使用CD90-Bv650(Clone 5E10), CD38-Bv785 (Clone HIT2), CD45-FITC (Clone HI30), LEPR-PE (R&D Systems, Clone 52263), Podoplanin-PE/Dazzle (Clone NC-08), CD56-PE/Cy7 (Clone 5.1H11), VE-Cadherin-Alexa Fluor 647 (Clone BV9)CD235ab-APC/Fire (Clone HIR2) 这些抗体对单细胞测序剩余的细胞进行染色、分选，并将分选后的细胞培养，用于评估分化潜力。同时，流式分选细胞培养的实验证实了MSC亚群的蛋白表达差异，并将Podoplanin确定为间充质干细胞的标志物。 - 结论：作者报告了目前最全面的健康人类骨髓图谱，涵盖了造血和非造血细胞类型及其空间结构，同时强调了测量所有骨髓细胞类型的重要性，表明动脉-骨内膜早期髓系邻域可能在治疗抵抗中发挥作用。
4. 细胞亚群的功能性分析
利用单细胞转录组测序技术，我们能够通过深入的生物信息学分析，精确识别并筛选出具有重要研究价值的特定细胞亚群。基于这些分析结果，我们进一步采用流式细胞术的多色流式分析技术，对这些细胞亚群进行一系列功能性评估，包括细胞增殖能力测试、细胞周期分析和凋亡状态评估。这些实验不仅全面评估了细胞的增殖速率、周期进程和对凋亡信号的响应能力，而且在细胞行为层面上为单细胞测序数据所预测的细胞功能状态、细胞间通讯的复杂过程提供了有力的额外验证。
4.1 常见的流式功能性验证方案（部分展示）
4.2 文献案例
- 影响因子：16.6
- 样本设计：IA-act(n=5),RA(n=8),IA-rem(n=5),HC(n=8)
- 研究路线：
- 相关图：
本文中，对收集到的样本处理后，进行单细胞测序，并进行数据分析，探究关节炎的免疫细胞图谱。同时，使用流式分析技术使用以下抗体：CD14-BV605 (clone 63D3, 1/20 dilution), CD11b-BV421 ( clone ICRF44, 1/20 dilution), CD4-APC/Cy7 (clone SK3), CD8-BV510 (clone SK1, 1/20 dilution), IL-1β-FITC (clone JK1B-1, 1/20 dilution), CCL3-PE (clone CR3M, 1/20 dilution), CCR1-APC/Cy7 (clone 5F10B29, 1/20 dilution), CXCL10-APC (clone J034D6, 1/20 dilution), CXCR3-APC (clone G025H7, 1/20 dilution) 对其进行鉴定分群，与单细胞测序得到的细胞群进行验证。 - 结论：这项研究揭示了免疫检查点抑制剂诱导的炎症性关节炎和类风湿性关节炎存在不同的细胞和分子途径，其中IL1B高表达的髓样细胞可能成为治疗免疫检查点抑制剂诱导的炎症性关节炎的潜在靶点。这项研究为进一步探究免疫检查点抑制剂的副作用提供了新的思路和研究方法。
技术平台介绍
1. 单细胞测序平台
单细胞测序凭借其极高的分辨率能够精准地剖析样本细胞组成信息，进而揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，并反映细胞间的异质性。10x Genomics的Chromium系统利用8通道的微流控体系，将含barcode的凝胶珠(GelBeads)、细胞和酶的混合物、油三者混合，形成GEMS(油包水)。GEMs形成后，细胞裂解，凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列，随后mRNA逆转录产生带有10x barcode和UMI信息的CDNA，构建标准测序文库。随着单细胞测序技术的不断更新和发展，其在解析细胞异质性，揭示微环境中细胞群体间的关系，追踪疾病发生发展等研究中将发挥越来越重要的作用，后续可为个性化预防、治疗提供技术支持。
1.1 仪器参数
10x Genomics Chromium Controller
1.2 技术原理
1.3 技术优势
- 通量高：一张芯片具有8个独立的通道，每张芯片可一次性对500‑80000个细胞进行建库。
- 测序捕获率高：单细胞捕获效率高达65%，多细胞比例<0.9%（1000个细胞）。
- 应用广泛：研究应用领城包括肿瘤学、免疫学、发育生物学、神经科学、病理学 。
- 延展性强：除了获得单细胞 mRNA 的信息，还提供了单细胞 TCR/BCR、单细胞表面蛋白等多种解决方案。
1.4 应用领域
癌症
研究癌症的发病途径和其他复杂的生物系统识别不同类型癌症的生物标志物；
基于蛋白质和/或转录本的癌症药物开发更全面的肿瘤微环境分析。免疫学
研究受体、细胞、应答细胞数量水平上的机制；
研究淋巴细胞与靶细胞之间的动态相互作用；
TTCR细胞基因工程和基于的融合蛋白筛选；
开发有效的接种疫苗 (抗体筛选)。神经科学与传染病
发现罕见的细胞类型和新的生物标记；
更完整的通路和细胞信号分析。人体细胞图谱/组织编目
增强组织和器官的表型；
构建更完整的框架以更好地了解疾病状态。
2. 流式细胞平台
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种对液流中排成单列的细胞或其它生物微粒（如微球、细菌、小型模式生物等）逐个进行快速定量分析和分选的技术，用于分析细胞表面和细胞内分子的表达、鉴定并确定异质细胞群中的不同细胞类型、评估分离亚群的纯度以及分析细胞大小和容积。这种技术可同时分析单个细胞的多个参数。被广泛的运用于从基础研究到临床实践的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及临床检验等领域，在各学科中发挥着重要的作用。
2.1 仪器参数
分析型仪器：Beckman DxFLEX
3激光配置488/638/405，可同时检测13个荧光通道；
搭载自动进样器。
分选型仪器：BD FACSAria™ III
4激光四路分选，可同时检测18个荧光通道；
搭载70um/85um/100um/130um规格的喷嘴，确保了从微米级到较大细胞群体的精确分选；
支持培养板分选功能，适应多样化的实验设计需求；
内置无菌和温控系统，确保细胞样本在最适宜的环境中进行分析和分选，从而保障实验流程的连续性和样本的生物活性。
2.2 技术原理
2.3 技术优势
- AI自动化流式分析系统：本系统结合自研的AI自动化分析处理系统与专家复核，能够对批量流式数据实施自动化智能分析，有效消除大规模数据处理过程中的人工差异，能够在3个工作日内高效处理超过万份的流式样本数据，分析效率提高数百倍。
- 仪器高通量检测：可在短时间内处理大量样本，快速分析成千上万个细胞或微球，实现批量样品的同时分析。
- 多参数并行分析：通过使用不同波长激发的荧光染料对细胞或微球上的多种刻可获取每个细胞上多个荧光通道的信息生物标志物进行标记，同一时从而进行多维度、多层次的研究。
- 高灵敏度：由于采用了高效荧光探针和精密的激光检测系统，即使是很低浓度的标记物也能被准确探测到。
- 定性与定量分析：进行细胞表型的定性分类，并实现蛋白质、核酸等生物分子表达量的定量测定。
2.4 应用领域
- 免疫学研究：利用流式细胞术的独特能力同时分析混合细胞群的多个参数，从而定义细胞群的谱系及表达量。
- 早期疾病诊断：鉴定和分析在疾病早期阶段发生变化的细胞种群标志物，为疾病早期诊断提供可靠的生物和检测靶点 。
- 药物研发：研究鉴定和分析药物对细胞和机体免疫反应的影响和作用机制，为药物研发提供有力的支持。
- 疾病治疗：鉴定和分析在不同疾病状态下的细胞族群改变及表达量异常变化，为疾病治疗方案提供可靠的支持依据。
【参考文献】
- Mazzinelli, Elena et al. “Oral Mucosa Models to Evaluate Drug Permeability.” Pharmaceutics vol. 15,5 1559. 22 May. 2023, doi:10.3390/pharmaceutics15051559
- Bandyopadhyay, Shovik et al. “Mapping the cellular biogeography of human bone marrow niches using single-cell transcriptomics and proteomic imaging.” Cell vol. 187,12 (2024): 3120-3140.e29. doi:10.1016/j.cell.2024.04.013
- Zhou, Ziyue et al. “Single-cell profiling identifies IL1B(hi) macrophages associated with inflammation in PD-1 inhibitor-induced inflammatory arthritis.” Nature communications vol. 15,1 2107. 7 Mar. 2024, doi:10.1038/s41467-024-46195-x