科研干货 | 36种PCR类型及其定义、原理和用途！

科研干货 | 36种PCR类型及其定义、原理和用途！

在现代分子生物学领域，聚合酶链式反应（PCR）技术无疑是科研和临床诊断中不可或缺的利器。自1983年Kary Mullis发明PCR以来，这一技术经历了无数的改进与发展，衍生出多种变体，以满足不同研究和应用需求。本文将系统梳理36种常见的PCR类型，深入探讨其定义、原理及应用场景，为科研工作者提供一份全面的参考。

一、基础PCR技术

1.常规PCR（Polymerase Chain Reaction）

定义：常规PCR是一种基于DNA聚合酶的体外扩增技术，能够在短时间内将目标DNA片段扩增数百万倍。

原理：通过高温变性（94-96°C）、低温退火（50-65°C）和中温延伸（72°C）三个步骤的循环，利用DNA聚合酶合成特异性DNA片段。引物结合到目标DNA序列的两端，限制扩增范围，从而实现特定序列的高效扩增。

应用：广泛用于DNA分离、扩增、定量，以及医学诊断、法医鉴定等领域。

二、特异性增强PCR技术

2.热启动PCR（Hot Start PCR）

定义：热启动PCR是一种通过物理或化学方法延迟反应启动，减少非特异性扩增的PCR技术。

原理：在反应混合物中分离关键试剂（如DNA聚合酶），直到加热至变性温度后才开始反应。这种方法可显著降低引物二聚体的形成和非特异性结合。

应用：适用于对特异性要求较高的PCR反应，如法医鉴定和基因分型。

3.降落PCR（Touch Down PCR）

定义：降落PCR是一种通过逐步降低退火温度来优化特异性的PCR变体。

原理：初始退火温度高于引物的最佳Tm值，随后逐步降低，直至达到目标温度。这种设计提高了反应初期的特异性，并在后期通过降低温度提高扩增效率。

应用：常用于复杂样本中目标序列的特异性扩增，如基因克隆和突变检测。

三、多靶标与高通量PCR技术

4.多重PCR（Multiplex PCR）

定义：多重PCR是一种在单次反应中同时扩增多个靶标的技术。

原理：通过设计多对引物，在同一反应体系中同时扩增多个目标序列。引物对的退火温度需经过优化，以确保反应的同步性。

应用：广泛用于基因分型、突变分析和病原体检测，尤其在诊断实验室中可用于同时检测多种病原体。

5.纳米粒子辅助PCR（NanoPCR）

定义：纳米粒子辅助PCR是一种利用纳米材料增强反应特异性和灵敏度的PCR技术。

原理：纳米颗粒可吸附引物和聚合酶，降低引物二聚体的形成，并提高反应的特异性和灵敏度。

应用：常用于病毒检测和基因测序，尤其在低浓度样本中表现出色。

四、基因编辑与重组PCR技术

6.重叠延伸PCR（Overlap Extension PCR）

定义：重叠延伸PCR是一种用于基因编辑和大片段拼接的技术。

原理：通过设计具有重叠序列的引物，将多个短片段连接成一个长片段。该技术可用于定点诱变和嵌合分子的生成。

应用：常用于基因克隆、大片段插入和删除，以及嵌合基因的构建。

7.组装PCR（Assembly PCR）

定义：组装PCR是一种从多个短片段组装出长DNA片段的技术。

原理：通过设计互补的寡核苷酸片段，在PCR过程中逐步连接成目标序列。该方法可实现复杂基因片段的高效组装。

应用：广泛用于合成生物学和基因工程，如蛋白质工程和基因合成。

五、遗传多样性与指纹图谱PCR技术

8.AFLP PCR（扩增片段长度多态性PCR）

定义：AFLP PCR是一种基于限制性酶切和选择性扩增的DNA指纹图谱技术。

原理：通过限制性酶切基因组DNA，连接接头序列后选择性扩增特定片段，生成独特的指纹图谱。

应用：用于评估遗传多样性、种群系统发育和遗传图谱构建。

9.ISSR PCR（序列间特异性PCR）

定义：ISSR PCR是一种基于基因组中重复序列的DNA指纹图谱技术。

原理：利用微卫星序列设计引物，扩增重复序列间的片段，生成特异性指纹图谱。

应用：常用于遗传多样性分析、基因组图谱构建和种质鉴定。

10.Alu PCR

定义：Alu PCR是一种基于Alu重复元件的DNA指纹图谱技术。

原理：Alu元件是人类基因组中最丰富的转座因子之一。通过设计与Alu序列互补的引物，同步扩增多个基因组位点。

应用：用于遗传性疾病的检测和癌症研究，因其在基因组中广泛分布，可作为遗传标记。

六、突变检测与基因分型PCR技术

11.等位基因特异性PCR（Allele-Specific PCR）

定义：等位基因特异性PCR是一种用于检测单核苷酸多态性（SNP）的技术。

原理：通过设计特异性引物，仅扩增目标等位基因，从而实现对突变位点的检测。

应用：广泛用于单基因遗传病的诊断，如镰状细胞性贫血和地中海贫血。

12.冷PCR（COLD PCR）

定义：冷PCR是一种选择性扩增低丰度突变DNA的技术。

原理：通过优化退火温度，使突变DNA优先扩增，从而提高突变检测的灵敏度。

应用：常用于肿瘤样本中突变的检测，尤其在异质性肿瘤中表现出色。

13.高保真PCR（High Fidelity PCR）

定义：高保真PCR是一种利用低错误率DNA聚合酶实现高准确性扩增的技术。

原理：使用高保真聚合酶，通过优化反应条件，减少扩增错误，提高序列准确性。

应用：适用于对序列准确性要求较高的实验，如克隆、SNP分析和NGS应用。

14.高分辨率熔解PCR（HRM PCR）

定义：高分辨率熔解PCR是一种通过检测DNA熔解曲线差异进行基因分型的技术。

原理：利用荧光染料结合双链DNA，通过熔解曲线的变化检测突变和多态性。

应用：常用于大规模基因分型项目，具有高效、低成本的特点。

15.甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR）

定义：甲基化特异性PCR是一种检测DNA甲基化模式的技术。

原理：通过亚硫酸氢盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，然后使用特异性引物扩增甲基化序列。

应用：用于研究基因表达调控和癌症发生机制，因为CpG岛的过度甲基化常导致基因沉默。

七、原位与细胞内PCR技术

16.原位PCR（In-situ PCR）

定义：原位PCR是一种在细胞或组织切片中原位扩增目标DNA的技术。

原理：通过固定细胞或组织切片，利用蛋白酶处理后直接进行PCR扩增，结合免疫细胞化学检测目标序列。

应用：广泛用于传染病诊断、微量DNA检测和胚胎发育研究。

17.菌落PCR（Colony PCR）

定义：菌落PCR是一种用于鉴定质粒中插入片段的技术。

原理：通过设计特异性引物，直接扩增细菌菌落中的目标DNA，鉴定正确的质粒重组。

应用：常用于分子克隆和基因工程中质粒的鉴定。

八、定量与实时监测PCR技术

18.实时定量PCR（qPCR）

定义：实时定量PCR是一种结合荧光信号实时监测DNA扩增的技术。

原理：通过荧光染料或探针实时检测PCR产物的生成量，实现对目标DNA的定量分析。

应用：广泛用于基因表达分析、病原体定量和转基因生物检测。

19.逆转录定量PCR（RT-qPCR）

定义：逆转录定量PCR是结合逆转录和实时定量PCR的技术。

原理：首先将RNA逆转录为cDNA，然后通过qPCR进行定量分析。

应用：用于研究基因表达、病毒载量检测和疾病诊断。

九、其他特殊PCR技术

20.非对称PCR（Asymmetric PCR）

定义：非对称PCR是一种优先扩增单链DNA的技术。

原理：通过调整引物浓度，使一条链的扩增量远大于另一条链。

应用：常用于测序和杂交探针的制备。

21.自杀式PCR（Suicide PCR）

定义：自杀式PCR是一种通过一次性使用引物组合避免污染的技术。

原理：引物组合仅用于从未扩增过的基因组区域，避免实验室污染导致的假阳性。

应用：常用于古遗传学研究，确保结果的可靠性。

22.反向PCR（Inverse PCR）

定义：反向PCR是一种用于扩增未知序列的技术。

原理：通过限制性酶切和连接反应，将目标DNA片段环化，然后利用已知序列的引物进行扩增。

应用：用于测定转座子和逆转录病毒的插入位置。

23.指数后线性PCR（LATE PCR）

定义：指数后线性PCR是一种非对称PCR的改进形式。

原理：通过设计不同熔解温度的引物，使反应在指数期后切换到线性扩增阶段。

应用：用于单链DNA的高效扩增，适用于测序和杂交分析。

24.连接介导的PCR（Ligation Mediated PCR）

定义：连接介导的PCR是一种通过连接接头序列进行扩增的技术。

原理：将接头序列连接到目标DNA片段上，然后利用与接头序列互补的引物进行扩增。

应用：用于DNA测序、基因组行走和DNA足迹分析。

25.长范围PCR（Long-Range PCR）

定义：长范围PCR是一种用于扩增长片段DNA的技术。

原理：使用具有高保真性和高延伸能力的聚合酶，优化反应条件以扩增长片段DNA。

应用：用于扩增基因组中的大片段序列，如基因克隆和基因组分析。

26.小引物PCR（Miniprimer PCR）

定义：小引物PCR是一种使用短引物进行扩增的技术。

原理：利用热稳定聚合酶，从短引物（9-10个核苷酸）延伸，扩增高度保守的DNA序列。

应用：用于检测高度保守的基因序列，如16S rRNA基因。

27.固相PCR（Solid Phase PCR）

定义：固相PCR是一种在固体支持物上进行扩增的技术。

原理：将引物固定在固体表面，通过空间分离减少引物二聚体的形成，提高反应效率。

应用：用于多重扩增和高通量分析。

28.RNase H依赖性PCR

定义：RNase H依赖性PCR是一种利用RNase H酶活性进行扩增的技术。

原理：通过RNase H酶切割引物上的RNA残基，实现特异性扩增。

应用：用于减少非特异性结合和引物二聚体的形成。

29.单特异性引物PCR（SSP-PCR）

定义：单特异性引物PCR是一种仅使用单个引物进行扩增的技术。

原理：通过单个引物从已知区域向未知区域扩增，实现基因组的单向行走。

应用：用于扩增部分序列信息已知的基因。

30.可变串联重复序列PCR（VNTR-PCR）

定义：可变串联重复序列PCR是一种基于VNTR序列的DNA指纹图谱技术。

原理：通过扩增VNTR序列，生成个体特异性的DNA指纹图谱。

应用：用于法医学个体鉴定和种质分析。

31.基于重复序列的PCR（Rep-PCR）

定义：基于重复序列的PCR是一种利用基因组中重复序列进行指纹图谱分析的技术。

原理：利用重复序列设计引物，扩增多个基因组位点，生成特异性指纹图谱。

应用：用于细菌菌株分型和流行病学研究。

32.逆转录PCR（RT-PCR）

定义：逆转录PCR是一种将RNA逆转录为cDNA后进行扩增的技术。

原理：首先利用逆转录酶将RNA转化为cDNA，然后通过PCR进行扩增。

应用：用于研究基因表达、病毒检测和遗传病诊断。

33.巢式PCR（Nested PCR）

定义：巢式PCR是一种通过两轮扩增提高反应特异性的技术。

原理：第一轮扩增较大片段，第二轮使用内部引物扩增目标序列。

应用：用于检测低丰度目标DNA，如病原体检测和基因克隆。

34.基于重复序列的PCR（Repetitive Sequence-Based PCR）

定义：基于重复序列的PCR是一种利用基因组中重复序列进行指纹图谱分析的技术。

原理：通过设计针对重复序列的引物，扩增多个基因组位点，生成特异性指纹图谱。

应用：用于细菌菌株分型和流行病学研究。

35.热不对称交错PCR（TAIL-PCR）

定义：热不对称交错PCR是一种用于回收与已知序列相邻的未知序列的技术。

原理：通过嵌套引物和任意简并引物的组合，逐步扩增未知序列。

应用：用于克隆全长基因和基因组测序。

36.降落PCR（Touch Down PCR）

定义：降落PCR是一种通过逐步降低退火温度优化反应特异性的技术。

原理：初始退火温度高于引物的最佳Tm值，随后逐步降低，直至达到目标温度。

应用：常用于复杂样本中目标序列的特异性扩增，如基因克隆和突变检测。

PCR技术的多样性和灵活性使其在现代生物学研究中占据了不可替代的地位。从基础的DNA扩增到复杂的基因编辑，从单靶标检测到多通量分析，PCR技术的每一次改进都为科学研究和临床应用带来了新的可能。本文所介绍的36种PCR类型仅是冰山一角，随着技术的不断发展，未来还会有更多创新的PCR技术涌现。对于科研工作者而言，了解并掌握这些技术的原理和应用，无疑将为他们的研究提供强大的助力。

在实际应用中，选择合适的PCR技术需要综合考虑实验目标、样本类型和实验条件。无论是追求高灵敏度、高特异性，还是高通量和低成本，总有一种PCR技术能够满足需求。