【血液样本处理全攻略】1——如何采集、保存

【血液样本处理全攻略】1——如何采集、保存

血液样本的采集和保存是生物医学研究中的重要环节，其质量直接影响后续实验结果的准确性和可靠性。本文将从血液样本的组分、采血管选择以及采集后的保存方法等方面，详细介绍血液样本处理的关键技术和注意事项。

一、血液样本中的组分

血液是在人体的循环系统、心脏、骨髓和血管腔内循环流动的一种组织，约占成人体重的1/13，血液中含水量约80%，血液密度为1.05~1.06g/cm^3。

全血分为三个部分：血小板和血浆、有核细胞（或单个核细胞）、红细胞及分叶核细胞（粒细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞）。

增加抗凝剂的全血自然沉降或离心处理后，在上层的淡黄色液体，称为血浆。

单个核细胞可分为髓系和淋系两大部分。髓系主要就是单核细胞、粒细胞、树突状细胞。淋系就是我们常说的淋巴细胞，主要就是T、B、NK细）。外周血免疫细胞就是指外周血中各白细胞的统称。

二、采血管的选择

1. 不同采血管及其用途

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2. 采血管的选择注意事项

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3. 流式细胞仪研究常用分析的推荐抗凝剂和储存时间

针对后续的流式检测方法学，不同的检测靶细胞，不同的检测指标，建议推荐不同的最佳抗凝剂选择，以及不同的稳定时长。

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三、采集后的血液该如何保存

尽管我们推荐在采集外周血后，立即进行外周血样本制备用于流式细胞术分析，但避免不了其他因素影响，比如远距离运输，外周血样本短长期保存，保存温度等等因素。如下列出集中常见的外周血保存方式：

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不同的保存条件、保存温度、保存时间对最终结果会有何影响，通过如下文献说明：

实验workflow

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1. 固定剂的影响

外周血采集到K3EDTA管中，4°C保存。样本分为三批，一批为control未经固定，一批直接用1%多聚甲醛（PFA）固定，一批用商业化Fix&Perm溶液（F&P）处理。在不同时间点（0h，6 h, 18 h, 24 h, 30 h, 42 h, 48 h, 66 h 和 72 h）进行上机检测。上机结果通过阳性群和阴性群的MFI来评估。

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结论：

在染色后4℃保存72h，除了PE-CD16+56和PE/CY7-TCRγδ的MFI有降低，其他指标的的表达水平都相对稳定，但是绝大多数指标的背景信号增加，总体来看细胞的分群没有受到影响。除了Neutro中性粒细胞在72h超出了可接受误差范围之外，其他细胞亚群在72h以内是稳定的。两种不同的固定剂1%PFA和商品化F&P相比，细胞的分群或者表面抗原的表达并没有出现明显的差异。但是对于一些检测指标（如BV510-CD45RA、percp-cy5.5-IgM等）的MFI降低。

2. 温度的影响

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结论：

1. 室温RT时，CD27 BV421和TCRγδ PE-Cy7的MFI信号最不稳定（从42小时开始MFI>下降30%）
2. 在4°C时，最受影响的指标是CD3 APC和TCRγδPECy7（24小时后MFI>下降30%）。大多数细胞群仍然可以在72小时内被识别出来。在APS视图中，（CD16+）单核细胞、NK细胞、中性粒细胞和B细胞偏离了参考数据。
3. 而在4°C存储的PB中，B细胞、T细胞和pDCs群体在随后的时间点（>24 h）降低，CD16+单核细胞和NK细胞与control偏差有限。
4. 主要是髓系来源的细胞群的半衰期等于或小于24小时（中性粒细胞6-8小时，嗜酸性粒细胞18小时，单核细胞1-2天）事实上，在RT下保存24小时的血液中，嗜酸性粒细胞的频率降低了55%，CD16+单核细胞的频率降低了27%
5. 中性粒细胞的相对损失仅达到9%，有相当一部分已经显示出凋亡的早期迹象）
6. 单核细胞在4°C时比在RT时保存得更好。然而，在RT下存储的样品总体上比在4°C下存储的样品更稳定。

3. Transfix和Cyto-Chex比较

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结论：

1. 两种固定方法都导致了大约一半的检测标记物的MFI初始下降（>为10%）。在所有病例中，受影响最大的标志物是CD16 + CD56 PE和CD27 BV421（>30% MFI损失），其次是CD8 FITC和TCRγδPE-Cy7（>MFI值降低10%）。
2. TransFix导致CD45RABV510（4°C时>增加10%）和IgMPerCP-Cy5-5-5（RT时>增加10%）的信号强度发生变化，细胞chex固定与CD4 PerCP-Cy5-5信号强度降低（>10%）相关。随着时间的推移，细胞-chex管中的所有标记物和经transfix处理的样本中的大多数标记物的MFI均进一步下降。mfi降低、背景增加和细胞散射影响阻碍了几个细胞的识别
3. 细胞双链和碎片的数量增加，这很可能是由于细胞死亡的增加和固定的副作用（数据未显示）。在RT下保存的transfix处理的样本显示，所有全血固定样本的群体表型保存最好。
4. 在存储在4°C的transfix处理的样本中，髓系细胞从一开始就受到严重影响。在24小时时，中性粒细胞、CD16+单核细胞和NK细胞已经偏离了基线样本的>1SD。嗜酸性粒细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞的偏差随时间逐渐增加。对细胞-chex处理的样本的评估显示，在大多数时间点，pDCs、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、CD16+单核细胞和嗜酸性粒细胞的鉴定受阻。因此，全血固定似乎对骨髓来源的细胞有最大的有害影响。
5. Cyto-Chex对维持细胞数量更为有效，而TransFix对细胞表面抗原信息的保存更为有效果。所以依然建议根据检测目的不同选择合适的全血保存剂。

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样本收集按照后续实验需求进行处理，包括血清、血浆、裂红、PBMC处理，欢迎持续关注后续外周血样本制备文章。

参考文献：

1. Collection, Storage, and Preparation of Human Blood Cells.
2. Impact of blood storage and sample handling on quality of high dimensional flow cytometric data in multicenter clinical research.
3. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry.
4. Peripheral blood mononuclear cell phenotype and function are maintained after overnight shipping of whole blood.
5. Ten-color 15-antibody flow cytometry panel for immunophenotyping of lymphocyte population.