华中科技大学和四川大学揭示生酮饮食重塑代谢的新机制

华中科技大学和四川大学揭示生酮饮食重塑代谢的新机制

赖氨酸β-羟基丁酰化（Kbhb）是由生酮饮食（KD）诱导的翻译后修饰，而许多研究已经证明生酮饮食对多种人类疾病具有治疗作用。很少有人知道Kbhb是如何调节细胞过程的。

2024年8月，华中科技大学薛宇团队和四川大学贾大团队在Nature Metabolism(IF=18.9)发表了题为“Ketogenic diet reshapes cancer metabolism through lysine β-hydroxybutyrylation”的研究论文，该研究通过对小鼠肝脏的多组学分析表明，蛋白质Kbhb受到KD（生酮饮食）的强烈影响。

研究材料

• 对照饮食小鼠（Ctrl）：25只
• KD小鼠体：26只
• 肝癌类细胞
• 肿瘤移植动物模型

技术路线

1. 转录组学、蛋白质组学、赖氨酸β-羟基丁酰化组学和代谢组学检测分析发现重要通路和重要修饰
2. 分层学习框架（pFunK模型）实现了赖氨酸β-羟基丁酰化功能的精准预测
3. pFunK-Kbhb预测潜在具有重要功能的赖氨酸β-羟基丁酰化位点
4. 细胞验证pFunK模型统计结果，从而揭示了生酮饮食重塑代谢的新机制

研究结果

1. 本研究的主要步骤

KD导致小鼠体重显著下降，显著提高了血液中的酮体 β-羟基丁酸（β-OHB）水平，降低了血糖水平，同时显著增加了Kbhb表达水平（图1a-d）。接下来将小鼠肝脏进行了多组学分析：转录组学、蛋白质组学、赖氨酸β-羟基丁酰化组学和代谢组学（图1e）。为了预测功能上重要的Kbhb位点，通过分层学习框架开发了pFunK模型，量化了Kbhb位点，预测到27种蛋白质中33个潜在的重要Kbhb位点。通过免疫印迹、免疫沉淀、荧光显微镜、伤口愈合试验、集落形成试验和肿瘤异种移植物等实验方法，研究了ALDOB-Kbhb在调节酶活性、mTOR信号通路和肿瘤增殖方面的作用。

图1 本研究的主要步骤

2. 小鼠肝脏的多组学分析

通过肽的MS/MS光谱计数，发现3492（62.29%）个β-羟基丁酰化肽（图2a）。通过比较转录组、蛋白质组和赖氨酸β-羟基丁酰组数据，发现差异主要富集在脂质生物合成和转运过程（图2b-d），进一步代谢分析表明Kbhb修饰和能量代谢之间存在潜在的相关性（图2f-g）。通过26种双特异性酪氨酸磷酸化调控激酶检测结果，预测Kbhb修饰可能通过影响酶的催化活性和/或底物结合而发挥作用。

图2小鼠肝脏多组学的联合分析

3. Kbhb位点功能相关性的预测（pFunK模型介绍）

作者开发了一个分层学习框架，以预测功能性Kbhb位点（图3a）。pFunK与其他机器学习模型相比，准确性显著提高了（图3b-d）。pFunK还可以明确地区分功能性Kbhb位点和其他Kbhb位点（图3e）。并生成了混淆矩阵来可视化实际结果和预测结果之间的一致性（图3f-g）。pFunK在预测赖氨酸修饰位点、Kbhb位点和功能重要的Kbhb位点方面表现出卓越的性能。

图3 pFunK的层次结构和性能

4. pFunK的实验验证

pFunK筛选出27种蛋白质中的33个潜在功能性Kbhb位点，接下来，重点研究排名靠前的六个Kbhb（图4a-b）。在不同酶的Lys修饰位置引入了谷氨酰胺残基，其模拟了β-羟基丁酰化赖氨酸，除p.Lys97Gln突变体的酶活没有变化外，其他突变体的酶活性显著降低（图4c-g）。检查了六个位点的β-羟基丁酰化肽的MS/MS光谱，发现每个β-羟基丁酰化肽中至少可以明确识别出四对b离子和y离子（图4h-k）。因此证明pFunK是预测Kbhb位点的有力工具，可以通过Kbhb改变蛋白质的功能。

图4 pFunK预测Kbhb位点的实验验证

5. KD促进ALDOB的Kbhb表达并抑制mTOR信号传导

ALDOB可以催化果糖-1,6-二磷酸（FBP）转化为肝脏中的二羟丙酮磷酸盐和甘油醛3-磷酸（图5a）。KD可提高ALDOB上的Kbhbb表达水平，并且抑制ALDOB酶活性（图5b-c）。在细胞中，β-OHB也可以抑制ALDOB酶活性并增加ALDOB-Kbhb表达水平（图5d）。免疫沉淀也表明Na-β-OHB抑制ALDOB酶活性（图5e）。通过测量mTORC1下游靶点p-S6K和p-4EBP1的磷酸化水平（图5f），表明KD强烈抑制了mTOR通路。且ALDOB K108bhb能降低和FBP的结合，从而降低mTOR信号通路（图5g-i）。

图5 ALDOB Lys108bhb减弱mTOR信号通路

6. ALDOB-Lys108的Kbhb抑制癌症细胞增殖

通过肿瘤细胞增殖实验、划痕实验、裸鼠皮下成瘤实验、qPCR实验等证明ALDOB K108bhb抑制癌细胞mTOR信号通路和糖酵解过程，削弱癌细胞增殖（图6）。

图6 ALDOB Lys108bhb抑制HCC和其他类型癌症的细胞增殖

7. 重要功能性Kbhb位点的潜在作用

ALDOB-Lys108bhb确实抑制mTOR信号通路，阻碍糖酵解并阻碍癌症增殖（图7a-c）。通过网络构建可以看出，ALDOB在mTOR信号通路、糖酵解和癌症增殖中的功能重要性（图7d）。pFunK模型计算的AUC值>0.9（图7e-f）。重组野生型HADH和突变体的酶活性也是类似的结果（图7g）。

图7 具有潜在功能性Kbhb位点的蛋白质的网络分析

总结

在肝癌细胞中消耗KD或补充β-OHB会增加ALDOB Lys108bhb并抑制ALDOB的酶活性。p.Lys108Gln减弱ALDOB活性及其与底物FBP的结合，抑制哺乳动物信号传导和糖酵解的靶点，并显著抑制癌症细胞增殖。该研究揭示了Kbhb在调节癌症细胞代谢中的关键作用，并为预测功能上重要的赖氨酸修饰位点提供了一种普遍适用的算法（pFunK）。