伤口愈合实验新方法：如何获得笔直均一的划痕
伤口愈合实验新方法：如何获得笔直均一的划痕
细胞划痕实验是研究细胞迁移的重要方法之一。传统的划痕方法存在划痕不一致、易损伤细胞等问题。本文介绍了一种使用ibidi伤口愈合插件的新方法，能够获得笔直均一的划痕，提高实验的重复性和准确性。
实验原理
伤口愈合实验是体外研究细胞迁移的一个有用的实验。原理是人为的在铺板的单层细胞中制造一个空白的无细胞的地带，然后对这个无细胞地带的边缘的细胞进行观察；这些边缘的细胞会开始进行迁移活动，并且最终覆盖整个无细胞的区域，重新互相接触在一起。
传统实验方法及其缺点
细胞在培养皿内贴壁后，使用移液器的头在贴壁细胞的中间划过，人为造成一道伤口（划痕），之后定时测量划痕的宽度，进而得到伤口愈合的细胞迁移数据。
实验缺点：
- 手动划痕，不能保证每次划痕的一致；
- 有时候在划细胞的同时会刮坏一片细胞，对划痕的边缘的细胞造成机械损伤；
- 如果培养皿底部还有包被蛋白的话，移液器划过，很可能伤害到包被，进而影响到细胞迁移，结果便很难判断是哪个因素造成了决定性的影响。
- 定时测量划痕的宽度，计算划痕宽度随时间推移的变化；在选取划痕测量点时，不可避免地引入了主观误差（人为选取了迁移结果符合实验预期的点）；
综上，传统的伤口愈合方法总是重复性不佳，对于实验结果的阐述说服力不足。
新方法：使用伤口愈合插件制造笔直均一的划痕
实验材料
- 细胞: MCF-7 (ATCC: HTB-22; DSMZ: ACC115)
- 实验耗材: ibidi 35 mm培养皿带伤口愈合插件(ibidi, 81176) ibiTreat
- 细胞培养基: RPMI (Sigma, R8758) + 10% FCS (Sigma, F0804)
- 细胞消化试剂: Trypsin-ETDA (Sigma, 59418C)
- 灭菌镊子
- 倒置显微镜，如果需要进行连续的观测最好搭配镜载加热孵育系统
实验步骤
- 铺细胞
为了获得更好的实验结果，在做实验之前最好进行一次预实验，以确定需要使用的细胞悬液的密度。我们建议，最好将细胞悬液密度调整为24小时后正好可以长满每个插件的小孔。
将ibidi伤口愈合培养皿底部的保护胶带撕除。
准备细胞悬液，调整悬液浓度为3*105 cells/ml，这样24小时后，细胞能刚刚长满单个小孔。
在ibidi细胞插件的每孔中加入70μl的细胞悬液。注意不要大力晃动培养皿。以防止细胞不均匀。
在37。C培养箱中孵育24小时。
图二：A. 去除培养皿底部的保护胶带。B.C.在ibidi伤口愈合插件中加入细胞。
- 形成“划痕”
当所有细胞都贴壁并且刚刚长满的时候，就可以开始伤口愈合实验了。用镊子将伤口愈合插件提出，之后加入新鲜的培养基，或者在培养基中加入刺激剂，然后观察伤口愈合的情况。
24小时后对细胞前一天种的细胞做镜检。细胞要贴壁并且是刚刚长满每个孔。长得过多移除插件时会带走很多细胞，长得过少，伤口愈合的效果很差。
如图三所示，小心的用镊子夹住插件的一个角，将插件移除。
图三：用镊子移除插件
移除插件后，要用显微镜检查是否形成合格的“划痕”（图四）。
小心的清洗细胞，之后加入2ml培养基进行培养。
图四 笔直均一的划痕
- 采集并分析图像
一般伤口愈合实验都是采集一张“划痕”的初始图像，再在实验结束时候采集一张“划痕”愈合的图像。我们建议可以在这个过程多做几个时间点，这样可以观测到细胞迁移随时间的变化特征。
在显微镜下选取能同时看到“划痕”和两边细胞的视野进行成像，“划痕”的方向最好在视野内为水平的或者垂直的。
MCF-7细胞每半小时采集一张图片，一直持续到20小时。
采用ibidi伤口愈合分析软件，统计细胞的覆盖面积，做出曲线图，可以看到在大约11个小时的时候，细胞基本就已经长满了，接下来几个小时细胞覆盖面积都不会发生变化（图五）。
图五(a) 显微镜下观察细胞覆盖面积的变化
图五(b) 细胞覆盖面积的数据统计
实验总结对比
本实验方法能得到重复性更好的划痕（图六）；
图六 通过计算划痕的面积可以看出，在多次实验中，移液器划痕（左图）制造的划痕面积数据波动大，重复性差；ibidi伤口愈合插件（右图）制造的划痕面积数据统一，重复性良好不会刮坏细胞，也不会造成划痕的边缘的细胞有机械损伤；
不会伤害到培养皿底部的包被蛋白；
图一：左图表示移液器划过后，底部包被蛋白被划伤，细胞迁移结果受到底部不均一的影响。右图ibidi插件移除后底部的包被蛋白没有被破坏。通过计算细胞覆盖面积得出细胞迁移结果，避免人为选取测量点，使数据更客观。1天内就能得到测量结果，实验分析更快更准确。
