微生物的分离培养方法、操作步骤及注意事项——划线分离法、涂布平板法

微生物的分离培养方法、操作步骤及注意事项——划线分离法、涂布平板法

微生物的分离培养是生物科学研究中的基础技术，掌握正确的分离方法对于获得纯净的菌株至关重要。本文详细介绍了划线分离法和涂布平板法两种常用的微生物分离培养技术，包括具体的操作步骤、技巧和注意事项，帮助读者从实验小白成长为分离培养的高手。

划线分离法

定义

利用接种环将目标菌种在固体培养基表面划线，菌种逐步稀释，培养后能够长出许多单一菌落，从而达到菌种分离纯化的目的。

目的

获得纯化的单菌落，越多越好。

操作步骤

1. 取菌种：取出目标菌种，融化后，备用；
2. 接种针灭菌：灼烧接种针进行灭菌；
3. 接种针冷却：将接种针移至酒精灯旁边冷却；
4. 蘸取菌种：甘油管用75%酒精消毒，待酒精挥发完全，在酒精灯火焰略微灭菌（防止烤糊），然后用接种环蘸取一环菌种；
5. 划线：取已经备好的固体平板，边转动平板边用酒精灯火焰灭菌，打开平板（靠口朝酒精灯），用上述接种环在平板上划线，先在一侧连续划线3-4次，边转动平板边用酒精灯灼烧接种环，冷却后，用接种环穿过第一次划线部分继续划线3-4次，同样方法进行第三次划线，或第四次划线（根据菌液浓度和菌种类型确定划线次数），灼烧接种环；
6. 标记：在平板底部边缘处标记菌种名称，日期和其他信息；
7. 培养：放置于恒温培养箱中培养；
8. 保存：待培养完成后保存于4℃冰箱，待用。

操作技巧

1. 甘油管菌种取出后，尽量不要放回去，或者标记清楚，反复冻融菌种效果不好。
2. 灼烧接种针时，一定要烧红。要烧红！要烧红！要烧红！重要的事情说三遍，不烧红灭菌不彻底，容易污染，也可能出不来单菌落。
3. 烧红的接种针一定要冷却后再使用，如何确定接种针是否冷却？用接种针沿着固体培养基内侧边缘或不可能用到的区域“轻点”，试一下固体培养基是否能够融化，如果融化，说明温度过高，继续冷却；如果不融化，说明接种针已经冷却，可以使用。
   
4. 甘油管菌种的浓度直接影响到划线区域的分布，如何确定甘油管菌种浓度？

• 第一种方法，事先查阅试验记录，确定甘油管菌种浓度。
• 第二种方法，借助显微镜观察，粗略判断甘油管菌种浓度。
• 第三种方法，测量吸光度，推测甘油管菌种浓度。

5. 划线过程，要求扫尾，扫尾出单菌落效果良好。但是，在实际操作中，很少人扫尾，因为有时候看不清尾部在哪，直接在附近区域划线，效果也不错。
6. 一定要标记清楚菌种信息和划线日期，一般情况在培养皿底部边缘处标记。

注意事项

1. 除样品外，所有试验都必须在无菌环境下进行，在打扫卫生、实验室消毒过程中，一定要做好个人防护。
2. 试验过程中，一定要正确使用酒精灯，避免着火。
3. 一定要在酒精灯旁边操作。
4. 试验结束一定要将无关物品从超净工作台中取出，该灭菌的物品一定要灭菌后再处理，避免交叉污染。
5. 试验过程中，尽量减少人员流动。
6. 试验过程中，避免手部接触平板边缘，以免造成污染。
7. 试验过程中，如果出现意外，比如说着火，别着急，拿上湿抹布覆盖即可。

涂布平板法

定义

待分离微生物样品经过一系列梯度（一般10倍递增）稀释后，使微生物菌体充分分散，成为单细胞，然后再取出一定量，涂布到固体培养基表面的方法，再经过适宜的培养条件，形成单菌落的过程。

目的

1. 获得纯培养物-目标菌。
2. 获得纯培养在微生物杂菌中的数量或比例—平板计数。

操作步骤

梯度稀释步骤：

1. 称量：准确称取待测样品1g或量取待测样品1mL。
2. 稀释：将上述样品放入装有99mL无菌生理盐水（有小玻璃珠）的250mL三角瓶中，记录。
3. 摇匀：将上述三角瓶放置于摇床上振荡30min，使微生物细胞充分分散，静置20-30s，即成10-2稀释液。
4. 继续稀释：再用1mL无菌移液器，吸取上述稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液和水混合均匀，即成10-3稀释液。
5. 继续稀释：再换一支无菌移液器，吸取10-3稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，即成10-4稀释液。
6. 继续稀释：以此类推，连续梯度稀释，制成10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液。

涂布平板步骤：

1. 标记：将事先制备好的无菌平板上标记10-7、10-8、10-9，每一个梯度稀释设置三个重复。
2. 涂布：用无菌移液器分别吸取10-7稀释液0.1mL放入编号10-7的3个平板中，然后用涂布棒或涂布器将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个涂布器，用完涂布器酒精灯灼烧灭菌。
3. 继续涂布：同样涂布10-8稀释液和10-9稀释液，切记更换涂布棒。
4. 培养：将涂布好的平板平放于超净台上静置10min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板放置于恒温培养箱中倒置培养。
5. 计数：至长出菌落后即可计数。
6. 保存：将单菌落平板储存至4℃保存。

计数原则：

1. 计数原则，平板上菌落数30-300个为合格。
2. 如果只有一个稀释度的平均菌落数，则以该稀释度平均菌落数除以涂布平板所用稀释液体积(0.1mL)，乘以稀释倍数作为该样品的细菌总数。
3. 如果有两个稀释度的平均菌落数符合要求，则按照两者菌落总数之比来决定，如果小于2，取两者的平均值如果大于2，取较小的菌落总数。

操作技巧

1. 前几个稀释梯度，尤其是第一个梯度适当放大稀释倍数。这样不容易丢失目标菌，也可以很好地对样品进行溶解。
2. 学会使用玻璃珠。玻璃珠的作用是研磨，尤其是粉末或颗粒性样品，可以将颗粒表面微生物与液体充分接触。
3. 勤换枪头或移液管。这样不容易造成不同稀释度间混乱，防止不同梯度间取样不准。
4. 一定要摇匀。平板涂布法的难点就在于稀释，稀释不准确后面一切都化为零，一定要摇匀再取样。
5. 利用显微镜粗略估测稀释倍数。并不是每一个样品都需要稀释到10-9，而是要根据样品中微生物的数量进行稀释。
6. 涂布完成后，静置10min再倒置培养。静置有利于微生物在培养基表面吸附，直接倒置培养，可能倒置菌液向一侧流动。
7. 倒固体培养基的时候，可以适当吹干或提前一到两天倒平板。平板表面没有多余水分且比较湿润，涂布时候既容易涂开也不会造成出现菌苔。

注意事项

1. 注意涂布力度，大小适宜，不应划破培养基的表面。
2. 如果发现平板上水太多，处理后再使用。
3. 切记写清楚标记。
4. 试验完毕，注意灼烧涂布器，以免影响环境，造成交叉污染。