呼吸道微生物组研究：一步PCR与两步PCR方案的比较
呼吸道微生物组研究：一步PCR与两步PCR方案的比较
在呼吸道微生物组研究中，PCR（聚合酶链反应）是关键的实验步骤。本文通过对比一步PCR和两步PCR方案，探讨了这两种方法对16S rRNA基因V3V4与V4区域测序结果的影响。研究发现，PCR步骤数量的差异会影响对呼吸道微生物群落的物种组成分析，且对上呼吸道（高细菌载量）的影响小于下呼吸道（低细菌载量）。
迄今为止，已经有了许多对呼吸道微生物组通过16S rRNA高通量测序的研究。这其中所有基于扩增子的研究的共同之处就是PCR的应用：
一是扩增待测序的目标标记基因，
二是为多样本的混合测序添加必要的索引序列。
这些步骤可以通过一步PCR或两步PCR完成，但没有研究说明两步PCR方案相关的实验室处理步骤是否会使样品比一步PCR方案更容易受到来自实验室的细菌DNA污染的影响。
本研究试图确定对16S rRNA V3V4与V4基因区域的一步或两步PCR的建库方案对上呼吸道和下呼吸道微生物组的影响。对收集的样本进行了三个设置下的lllumina MiSeq测序：
- 设置1（两步PCR，V3V4区域）
- 设置2（两步PCR，V4区域）
- 设置3（一步PCR，V4区域）
分别对这三个设置产生的测序数据进行分析。
方法
通过三个实验，即对模拟群落样品HM-783D、NCS样品、呼吸道样品采用三种PCR方案进行建库后的测序结果分析，研究这三种建库方案对其菌群描述的影响。
- 模拟群落样品HM-783D，来自20种不同细菌物种（17个属）的基因组DNA。
- 阴性对照样本NCS
- 呼吸道样品，从Bergen COPD微生物组研究中选择了23名研究对象，其中9名健康，4名患哮喘，10名患COPD（慢阻肺）。上呼吸道样本以漱口水（OW）为代表，下呼吸道样本以标本刷(PSB)和支气管肺泡灌洗液(PBAL)为代表。
三种PCR方案：
- 细菌DNA提取后通过三种不同的建库设置进行MiSeq测序，分别为
- Setup1（两步PCR，V3V4区域）；
- Setup2（两步PCR，V4区域）；
- Setup3（一步PCR，V4区域）
下图完整的展示了三个PCR设置下的使用呼吸道样本的生物信息学过滤步骤：
最终：
- 设置1：得到了666个ASVs
- 设置2：得到了310个ASVs
- 设置3：得到了291个ASVs
主要结果
1. 对模拟群落样品HM-783D的分析
在设置1中进行了四次测序，设置2和设置3分别进行了一次。与预期丰度（Expected）相比，柱状图中观察到三种PCR设置下的各菌属的相对丰度与预期丰度相差不大，表中数据显示，三种PCR设置都在恢复高丰度物种方面具有最高的效率，但设置3在回收低丰度物种时的效率最低。
2. 对阴性对照样品的分析
从上至下分别为设置123测序后，在NCS样品中观察到的20种最丰富的ASV。通过R包Decontam去除污染物，在设置23之间差异最大的是属于肠杆菌科的ASV，与后续的对水样品进行设置23下的测序分析结果相比较，发现大肠杆菌ASV就是在建库步骤中使用设置3的试剂时引入的污染物。
3. 对采集的呼吸道样品的分析
在去除污染物前后，代表为呼吸道菌群的链球菌，普雷伏氏菌，Veillonella和Rothia属的相对丰度变化不大，而去除污染物后，预测作为污染物代表的数量较少的物种被滤出。基于主坐标分析，发现高细菌载量的OW样品聚集在一起，低细菌载量PBAL，PSB一句设置23分离开。
去除污染物之前的三种类型样品的三种PCR设置下的物种分类
去除污染物后的
从左至右分别为去除污染物前后的未加权UniFrac距离的主坐标分析
OW：蓝色； PBAL：绿色；PSB：紫色；NCS：红色。
设置2（球形），3（菱形）
结论
文章作者给出的结论是文库制备和测序方法的选择会对呼吸道微生物组的分析产生影响，且对上呼吸道的影响小于下呼吸道。靶向扩增子区域的差异（16S rRNA基因V3 V4与V4）并未表现出对细菌群落描述的重大影响。对于整篇研究存在的主要的局限性在于仅研究了DNA提取后的PCR步骤，污染或影响也可能来自于更前期的处理。
在使用测序技术进行的微生物研究中，测序偏差和污染物是一直存在的问题，也因此诞生了许多工具和计算方法用于尽可能的消除或降低这方面的影响。这篇研究也提醒了我们，在呼吸道微生物组的研究中，要注意上呼吸道与下呼吸道的菌群差异或相似可能不仅仅来源于样本自身，还可能掺杂着PCR方法选择上的影响。**
参考文献：
Drengenes C, Eagan TML, Haaland I, Wiker HG, Nielsen R. Exploring protocol bias in airway microbiome studies: one versus two PCR steps and 16S rRNA gene region V3 V4 versus V4. BMC Genomics. 2021 Jan 4;22(1):3.