BV2细胞培养和基因编辑指南

BV2细胞培养和基因编辑指南

BV2细胞是鼠源小胶质细胞系，是E.Blasi从小鼠大脑小神经胶质细胞经逆转录病毒介导转染v-raf/v-myc而获得的永生化细胞系[1]，它保留了小胶质细胞许多特性。该细胞系在神经系统的免疫反应、炎症反应、神经退行性疾病等领域具有重要价值[2]，而它的培养和基因编辑是不少实验的基础环节。今天，小源和大家分享一些BV2细胞的培养和基因编辑的小技巧，希望能帮助大家在实验中少走些弯路，让实验更加顺利。

BV2细胞基本信息

图1 细胞生长正常(100×）
细胞主要呈现为圆形和梭形两种形态。星形细胞多为悬浮状态；贴壁细胞可能呈现圆形或梭形，有时会有短触角或凸起伸出。

图2 细胞生长状态差（100×）
细胞形态异常，如细胞脱壁、细胞形状改变、拉丝较多等

BV2细胞培养

1. 细胞复苏

1. 准备：取7mL完全培养基于离心管中备用
2. 解冻：将细胞从干冰里取出，用镊子夹住盖子放入 37℃水浴中快速晃动（注意：水不能没过盖子），使其在1分钟左右完全融化，直至冰块融化至绿豆大小，停止水浴
3. 离心：将解冻后的细胞悬液转移至离心管中，1100rpm条件下离心4分钟，弃去上清液
4. 重悬与接种：用完全培养基重悬细胞，接种于合适大小的培养皿或培养瓶中
5. 培养：将培养皿或培养瓶置于37℃培养箱中培养，24小时后观察细胞状态及贴壁情况

2. 细胞传代（以T25瓶为例）

1. 当细胞汇合度达到70-80%时可进行传代，传代时在超净台内弃去培养瓶里的培养液，加入5mLPBS洗涤细胞1-2次
2. 加入1mL胰酶，轻轻晃动瓶子并使胰酶完全浸过细胞，将培养瓶放入培养箱孵育 1分钟左右，在显微镜下观察到大部分细胞变圆变亮，轻轻晃动培养瓶两侧有大部分细胞脱落时，立即终止消化
3. 加入2倍胰酶体积即2mL完全培养基终止消化，然后转移至15mL离心管中
4. 1100 rpm 室温离心 4 分钟，离心结束，弃去上清，加入完全培养基重悬细胞
5. 细胞按照1:3-1:5比例传代，传代第二天观察细胞状态

3. 细胞冻存

1. 收集细胞：按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中
2. 离心：1100rpm条件下离心4分钟，去掉上清
3. 重悬与冻存：用细胞冻存液重悬细胞，按每1mL冻存液含1×10^6个细胞/mL分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息
4. 降温与储存：将冻存管置于程序降温盒中，-80℃冰箱中过夜后转入液氮罐内保存

细胞培养Tips

细胞培养注意事项

1. 注意培养基颜色，及时更换新鲜培养基：BV2细胞对培养基的pH值非常敏感，过酸或过碱的培养基都可能导致细胞状态变差甚至脱壁。
2. 悬浮细胞较多情况下传代和换液需要收集培养；若贴壁细胞较多且活性较好时，可以舍弃悬浮的细胞。
3. BV2细胞生长较快，培养基消耗较快。细胞密度较高、培养基有变黄趋势时及时换液，避免细胞状态变差。密度到达80%时及时进行传代，以防细胞过度生长。
4. BV2细胞冻存复苏后细胞贴壁性会变差，多数为悬浮细胞状态，培养48小时后收集悬浮细胞和贴壁细胞进行传代，细胞会呈现多边形贴壁细胞和悬浮细胞两种形态。
5. BV2细胞易出现分化现象，分化后的细胞贴壁更牢，极难消化。尽量缩短消化时间，预防细胞分化。若出现细胞分化情况，可以尝试通过轻柔地吹打将部分细胞吹下来，并与悬浮细胞一起收集进行培养，无法吹打下来的细胞直接舍弃，从而降低细胞的分化程度。

细胞状态差如何调整

1. 培养基和血清：确保使用正确的基础培养基和加入适量血清，血清浓度可根据细胞状态适当调整
2. 细胞培养环境：确认培养温度、湿度、气相条件是否正常
3. 避免使用过期或长时间存放的培养基，新鲜配制的完全培养基建议在两周内使用完毕
4. 细胞传代时，注意消化时间（1min左右）和胰酶浓度，避免因消化时间过长或过短导致的细胞损伤
5. 传代和换液时，轻柔吹打细胞，避免机械刺激造成细胞损伤

基因编辑Tips

BV2细胞转染时注意事项

1. 确保细胞状态良好，细胞处于对数生长期，细胞密度一般处在70-80%
2. 注意细胞消化时间，避免过度消化，对细胞造成伤害
3. 实验过程中细胞要吹打成单细胞，避免细胞聚团
4. 细胞进行实验时活率≥80%

电转法

1. 电转法进行实验时控制好电转细胞量，电转后接种到合适的培养板里
2. 用电转法进行实验时要保证电转后细胞贴壁率≥70%
3. 用电转法进行转染时需控制好实验时间，电转全程不宜过长

图3 电转BV2细胞（100×）

慢病毒法

1. 慢病毒法进行实验时要控制好感染前的细胞汇合度30%～40%之间，不可过高
2. 选用病毒法进行正式实验前可进行预实验找到最合适的MOI;感染前添加助染剂Polybrene
3. 对于转染试剂使用前需要充分混匀保证其均匀性

BV2细胞铺单克隆实验注意事项

1. 确保铺克隆实验前细胞状态正常，老化细胞少，建议控制细胞汇合度在70%左右
2. 铺克隆时细胞活率≥90%
3. 可先进行预实验找到合适的铺克隆梯度，避免单克隆占比太低
4. 稀释细胞计数后结果最好落在110^6-210^6之间

参考文献

• [1] Blasi, E et al. “Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.” Journal of neuroimmunology vol. 27,2-3 (1990): 229-37. doi:10.1016/0165-5728(90)90073-v
• [2] Henn, Anja et al. “The suitability of BV2 cells as alternative model system for primary microglia cultures or for animal experiments examining brain inflammation.” ALTEX vol. 26,2 (2009): 83-94. doi:10.14573/altex.2009.2.83