多色流式细胞术的配色方法与技巧

多色流式细胞术的配色方法与技巧

流式细胞术是一种强大的细胞分析技术，能够对细胞表面和内部的蛋白质、DNA、RNA等进行定量检测和分类。在多色流式细胞术中，如何合理搭配荧光染料是实验成功的关键。本文将详细介绍流式抗体的特点、类型以及多色流式细胞术的配色技巧，帮助研究人员优化实验设计和数据分析。

流式抗体的特点与类型

流式抗体（FACS Antibody）是专为流式细胞术设计的抗体，用于检测和分析细胞表面或内部的特定蛋白质。这些抗体通常带有荧光标记，流式细胞仪通过检测其发出的荧光信号来识别并分析细胞特征。

图1：流式抗体的工作原理示意图

流式抗体的特点：

1. 荧光标记：流式抗体通常结合荧光染料，如FITC、PE、APC等，便于在流式细胞仪中检测目标抗原的表达水平。
2. 高特异性和亲和力：抗体需对目标抗原高度特异，以确保流式检测中的精确性。
3. 低非特异性结合：流式抗体通常经过优化，以减少非特异性结合，提高信噪比。
4. 稳定性：流式抗体的荧光标记物应在实验条件下具有较高的稳定性，以保证信号不受环境光和样品处理的影响。

流式抗体的类型：

1. 单克隆抗体：针对单一抗原表位，提供一致性高、特异性强的信号，是流式细胞术中的首选。
2. 多克隆抗体：识别抗原的多个表位，信号强度较高，但特异性较单克隆抗体低，通常在特定应用中使用。
3. 直接标记抗体：抗体直接结合荧光染料，用于单一染色，便于操作，信噪比较高。
4. 间接标记抗体：使用未标记的抗体加上荧光标记的二抗，用于增加信号强度或在稀有抗体不足的情况下应用。
5. 异型对照抗体：用作阴性对照，以确保信号特异性，排除非特异性结合的影响。

流式抗体的选择

1. 抗体的特异性和亲和力：根据目标抗原，选择已验证具有良好特异性和亲和力的抗体，以确保检测的准确性。
2. 荧光染料的选择：根据多重染色实验的要求选择不同光谱的荧光染料，避免光谱重叠并优化信号检测。
3. 抗体来源：选择与实验物种匹配的抗体来源，以减少交叉反应。
4. 直接或间接标记：对于高表达抗原，直接标记抗体更简便；对于低表达抗原，间接标记抗体可提高信号。
5. 适当的对照：包括异型对照、未染色对照、单染色对照等，以校正信号背景和优化数据分析。

多色流式细胞术的配色技巧

流式细胞实验表面上是一个非常简单的试验，但是对于大多数新手来说，除了要慎重选择抗体之外，还要熟悉如何进行荧光配色，最大限度地减少对补偿和重叠的调整，这也是流式实验的重中之重。

技巧1：选择合适的目标Marker并确定Marker的表达位置

通过查阅相关文献，在试验之前需要确定好Marker以及Marker之间的逻辑关系（圈门的父子关系，比如T细胞CD3是“父”，而CD4或者CD8就是“子”）。

对于细胞质或者细胞核的Marker，需要对细胞进行固定破膜/破核膜。在做胞质或胞核Marker染色实验操作时，需要先染细胞表面Marker，再对细胞进行固定破膜，最后对胞内或核内Marker染色。

一般来说，绝大部分CD分子指标，都是细胞表面指标；IL白介系列、IFN-γ、TNF-α等，属于胞内指标；而最常见的核内染色指标是Foxp3。

技巧2：选择流式细胞仪能检测的染料

要充分了解流式细胞仪有哪些激光器，有哪些滤光片通道，充分利用仪器允许的全部荧光染料，尽量选用多激光激发。

图2：不同激发器可激发的荧光染料

技巧3：强弱互补

荧光染料亮度有强弱之分，抗原表达有高低区别，因此弱表达抗原应该选择强荧光染料，强表达抗原选择弱荧光染料，使染料的亮度与抗原密度匹配。

通常，根据待测细胞类型中，相应抗原的表达量，可以粗略地将抗原分子分为三类：

1. 很容易鉴定、容易区分阴阳性细胞群、阴阳性峰明显分开的抗原。例如：CD3，CD4，CD19等。
2. 很容易鉴定、较高水平表达、经常连续性表达。例如：CD27，CD28，CD45RA, CD45RO等。
3. 低水平表达、激活性Marker、未知但关键。例如：CD25，STAT5，Foxp3等。

同样，弱表达抗原放在被干扰较小的检测通道，而强表达抗原放在对其他通道干扰较小的检测通道。比如FITC、PE、PE-Cy7、APC这四色一起检测时，弱表达抗原应该搭配APC荧光染料标记的抗体；强表达的抗原最终染色的信号较强，容易对其他检测通道造成干扰，因此我们应该选择对其他通道干扰较小的荧光染料。

因抗原表达密度受细胞类型以及细胞活化程度的影响，所以在此无法详细列出各抗原的表达密度强弱。但荧光染料的强弱是固定的，荧光的强度与染色指数(Stain Index)有关，一般染色指数越高，荧光强度越好；染色指数较低，染色强度相对较差，通过染色指数可以直接比较出各个荧光染料的强度。

图3：不同类型荧光染料的染色指数排行

技巧4：表达互相排斥的抗原可以放在相互干扰较大的检测通道，共表达的抗原避免放在相互干扰的通道

表达相互排斥的抗原指的是两种抗原不会同时表达在一种细胞上，这两种抗原表达在两种细胞上（例如CD4和CD8），因此流式图上分群很明显，即使荧光染料之间干扰很大，也很容易通过补偿的调节避免干扰；

而共表达的抗原指的是这两种抗原表达在同一种细胞上（例如CD4和CD25），在流式图上我们是要分析双阳性的细胞比例，因此如果这两个抗体对应的荧光染料之间有干扰，则会对圈门结果造成干扰，影响分析的细胞比例。

当然，选择优质的特异性抗体是实验成功的根本保证。在设计多色流式panel时，重要的是要了解仪器的配置，以及如何最佳地组合多种荧光染料，以最大程度地减少光谱重叠、提高结果的准确性。

参考资料

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2. Flores-Montero J,et,al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019 Dec;475:112618.
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