一文掌握HCP全套检测方法：商品化or定制化&抗体覆盖率
一文掌握HCP全套检测方法：商品化or定制化&抗体覆盖率
生物制品在生产过程中不可避免地会引入宿主细胞蛋白（HCP）杂质，这些杂质可能引发人体安全性风险。因此，建立合适的监测策略以控制终产品中HCP的含量，是确保药物质量的关键环节。本文将为您详细介绍HCP的检测方法及其重要性。
HCP概念和检测的必要性
生物制品通常是通过重组技术经由宿主细胞（如细菌、酵母、哺乳动物、昆虫或植物细胞）进行生产的，产品类型包括单克隆抗体、重组蛋白和疫苗等。这些产品的制造和纯化过程不可避免的会引入宿主细胞蛋白（Host Cell Protein，HCP）杂质，既包括宿主细胞的结构蛋白也包括宿主细胞分泌的促生长因子等，是具有多种生理化学和免疫学特性的复杂混合物。尽管使用先进的纯化技术，但一些宿主细胞蛋白仍将作为工艺相关杂质残留在中间药物产品中。
这些杂质有潜在的免疫原性，也可能作为佐剂增强生物药物的产品的免疫反应，还会影响产品的稳定性和功效，从而引发人体安全性风险，因此，对于HCP的去除水平需要建立合适的监测策略，并控制终产品中HCP的含量以符合药物质量的要求。
HCP法规监管要求
生物制品中HCP残留含量通常被认为是产品的关键质量属性(CQA)，是工艺稳健性监测的重要评价指标，也是产品的重要质控指标。各国法规都有涉及HCP的论述，要求必须对生物药品进行分析和纯化，以将宿主细胞蛋白HCP降低到可接受的水平。对HCP的接受程度将根据具体情况进行评估，并取决于多个因素，其中包括：剂量、给药频率、药物类型和疾病严重程度。
- 《中国药典》三部（2020版）规定：针对CHO细胞，HCP残留需要<0.05%（相当于小于500ppm）；针对E.coli，HCP残留需要<0.01%。
- 美国药典USP<1132>章节规定：用一种灵敏度较高的方法检测药品中的HCP，其含量应该低于检测限（通常小于100ppm，即1mg总蛋白中HCP含量应小于100ng，也即<0.01%）。
- 欧洲药典EP 2.6.34中规定：在生物制品中，HCP的含量应当小于0.1%。
- 国际人用药品注册技术协调会（ICH）指南：ICH Q6B指出，需要根据ICH准则采用敏感且经过验证的有效方法来监控残留的HCP，其残留量通常要求小于100ppm。
由此可见，监管机构对于HCP的要求是高度一致的，生物制品的工艺开发必须经过HCP检测，并证明纯化工艺能够将HCP降低到安全水平，并且在最终产品的残留量限值中，中美的推荐限度值均在0.01%以下。
HCP检测方法
酶联免疫吸附法（ELISA）是目前HCP检测最常用的方法，在2020版《中国药典》通则3412/3413/3414中提到的宿主蛋白残留检测方法均为ELISA法。
美国药典USP<1132>章节中也提到可采用电泳法、ELISA和LC-MS/MS等方法检测HCP含量，且由于ELISA法操作简便、快速、高灵敏、高通量等特点，而被推荐为HCP检测的首选方法。
酶联免疫吸附测定(ELISA)
用途：
检测HCP中蛋白的总量，可用于产品开发和过程控制，目前是检测HCPs的常用方法。
优势：
- 高灵敏度和特异性；
- 高通量及可实现自动化；
- 定量性；
- 操作简便、快速。
劣势：
- 需要特异性抗体；
- 无法特异鉴别和评估单个HCP；
- 方法开发较为复杂，抗原需要特殊制备；
- 方法的影响因素较多，HCPs覆盖率需评估；
- 无法鉴定出种类。
免疫印迹(Western Blotting)
用途：
用于大量样品的一致性筛选，以及检测与抗HCPs抗体反应的未知蛋白。适用于检测HCPs,并提供HCPs相对分子质量的大概信息。
优势：
- 特异性；
- 结果直观可视化：通过蛋白质大小和表达水平的差异进行可视化；
- 可检定和定量特定的HCP。
劣势：
- 半定量性；
- 仅限于特定蛋白：只能检测到与抗体结合的HCP；
- 对复杂蛋白质混合物不够敏感；
- 蛋白质SDS变性可能导致构象表位的丢失；
- 灵敏度需依赖多克隆抗体质量。
二维凝胶电泳法(2-DE)
用途：
常用于上游或下游工艺开发和表征，其可在单一凝胶上分辨不同HCPs。
优势：
- 不需要免疫印迹，避免了转膜的问题；
- 可以实现痕量HCPs杂质与产品的分离；
- 提供大概相对分子质量和等电点信息。
劣势：
- 过量的蛋白可能会掩盖HCPs斑点；
- 可观察到样品中HCP的分布，但无法量化。
质谱分析(Mass Spectrometry)
用途：
鉴定单个HCP，提供准确的宿主细胞蛋白鉴定和定量信息
优势：
- 高分辨率和准确性；
- 鉴定及监控各个HCP；
- 提供HCP的全面谱图；
- 能够覆盖广泛的蛋白质；
- 可鉴定出HCP种类。
劣势：
- 设备和技术要求高；
- 操作较为复杂；
- 成本较高；
- 方法通量低；
- 较为复杂的样品前处理；
- 潜在的基质影响；
- 需要专业的数据分析能力。
ELISA是各国药典推荐的在生物制品中检测残留HCP的方法，可以测定HCP的总量，但其存在局限性，无法鉴别HCP的种类及丰度，需要其他方法与之互相补充。每种检测方法都各有其优缺点，在实际应用中，可以根据实验目的、样品特性、准确性和操作便捷性等方面进行选择，结合使用不同的方法来获得更全面和准确的结果。
此外，美国药典USP<1132>和欧洲药典EP2.6.34. HOST-CELL PROTEIN ASSAYS指出在产品开发的不同阶段，推荐采用不同的ELISA试剂盒用于HCP的检测，并将HCP检测方法分为：商业化试剂盒、产品/工艺专属性方法和平台化方法。
USP<1132>提到在没有平台化方法的情况下可以在临床前、临床I期、II期使用商品化试剂盒；在临床III期/工艺验证及产品上市后，由于商业化的通用HCP检测试剂盒抗体的覆盖率往往不足等局限性，需要考虑结合细胞类型及工艺特异性等因素，使用平台化方法或针对上游工艺开发的产品/工艺专属性方法。
图1.USP <1132>中产品开发的不同阶段HCP检测方法的建议
方法 | 通用商品化试剂盒 | 项目专属性检测方法 | 平台化检测方法 |
|---|---|---|---|
可用性 | 即时可用 | 需要制备抗原，包括克隆空载体细胞系 | 需要使用裸细胞系或空载体细胞系制备抗原 |
开发 | 无需太多准备工作 | 包括抗原表征、免疫和确认在内的检测开发至少需要6个月时间 | 包括抗原表征、免疫和确认在内的检测开发至少需9个月时间 |
多样性 | 仅限于最常见的表达系统 | 各类型表达系统均可用 | 各类型表达系统均可用 |
特异性 | 特异性可能不佳，很可能有未检测到的HCP | 特异性通常有所增强，抗体覆盖率更能针对特定的HCP模式 | 与商业检测方法相比，特异性有所提高，对检测性能的理解有所增强，对HCP种类的覆盖率也有所提高 |
费用 | 初期价格相对便宜，但对整个下游纯化过程而言，开发成本将迅速上升 | 初期成本较高，但收支平衡点通常是在100套试剂盒的价值 | 由于可用于多种产品，具有显著的成本优势 |
依赖性 | 依赖于某个供应商，试剂和控制方案属于“黑箱”状态。 | 能对所有试剂和缓冲液取得全面控制，可以随时进行调整 | 对所有试剂具有完整的所有权和控制权，可降低供应链和批次可比性的风险 |
监管需求 | 不适合用于支持上市许可申请 | 适用于支持许可产品从早期开发到最终产品上市的整个过程 | 适用于支持早期开发直至上市许可的整个过程 |
表2.不同HCP试剂盒类型的比较
HCP抗体覆盖率验证服务
已知，ELISA法是行业内检测HCP残留的金标准，然而该方法的准确性取决于多克隆抗体对HCP的覆盖率。《美国药典》和《欧洲药典》中提到免疫亲和纯化、2D-WB是表征HCP ELISA抗体及其覆盖率的推荐方法。
HCP抗体覆盖率平台
2D-WB首先采用二维凝胶根据大小和电荷分离蛋白质，然后将这些蛋白质转移到膜上与 HCP 抗体一起孵育以进行蛋白质印迹检测。
HCP抗体覆盖率服务
翌圣生物拥有全套2D-WB仪器设备和丰富的实验室操作经验，可针对CHO、E.coli、HEK293等宿主细胞的HCP样品，提供抗体覆盖率验证服务。
参考文献：
[1]USP <1132> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals.
[2]USP <1132.1> Residual Host Cell Protein Measurement in Biopharmaceuticals by Mass Spectrometry.
[3]EP-2.6.34. Host-Cell Protein Assays.
[4]2020版《中国药典》3412大肠埃希菌菌体蛋白质残留量测定法、3413假单胞菌菌体蛋白质残留量测定法、3414酵母工程菌菌体蛋白质残留量测定法。