重组胶原蛋白渗透性检测：深入解析其透皮吸收机制与评价方法
重组胶原蛋白渗透性检测：深入解析其透皮吸收机制与评价方法
重组胶原蛋白的透皮吸收是评价其在化妆品和护肤品中有效性的重要指标。本文详细介绍了重组胶原蛋白的透皮吸收机制、相关科学研究以及最新的检测标准，并通过迪诺薇华公司的RHCare® D系列产品案例，展示了小分子重组Ⅳ型人源化胶原蛋白的优异渗透性能。
重组胶原蛋白的透皮吸收机制
化妆品透皮吸收是指化妆品中的功能性成分按产品的有效性作用于皮肤表面或进入表皮、真皮等不同皮肤层, 并在该部位积聚和发挥作用的过程。对于重组胶原蛋白而言，能否真正被透皮吸收决定了其在终端应用上的宽度和广度，同时也是评价其有效性的重要指标[1]。
皮肤透皮吸收的“500道尔顿定律”又称Lipinski五法则：当物质分子量大于500道尔顿时，往往很难穿透角质层被皮肤吸收。目前容易直接被皮肤吸收的药物，分子量一般也在500道尔顿以下[2]。大分子胶原蛋白的分子量一般在几千到几万道尔顿，因此其透皮吸收存在较大挑战。如何有效促进胶原蛋白活性原料的渗透吸收，实现其对皮肤基底层与真皮层的活性作用，已然成为当下的研究焦点。
胶原蛋白分子的亲水基团具有吸水性，可增加皮肤角质层含水量。皮肤水分升高后，细胞膨胀降低了组织结构的致密程度，使得水溶性的胶原蛋白更容易透过角质层[3-4]。最近已有研究表明小分子胶原蛋白及胶原蛋白肽能够到达皮肤真皮层发挥功效[5]。
重组胶原蛋白的渗透性研究方法
迪诺薇华RHCare® D系列是小分子重组Ⅳ型人源化胶原蛋白及胶原蛋白肽，迪诺薇华研发团队通过荧光标记法、Franz扩散池法对其皮肤渗透性进行了定性及定量研究，实验证明RHCare® D具有很好的皮肤渗透性。
用荧光标记法定位RHCare® D在皮肤中的渗透深度，实验数据显示RHCare® D在渗透4 h后可穿过角质层并抵达基底膜，12 h后可渗透真皮全皮层。
图1. 荧光标记RHCare® D 4h和12h的皮肤渗透性
用Franz扩散池法对RHCare® D皮肤渗透性进行定量研究，经HPLC检测，其8 h皮内率可达78%。
图2. RHCare® D在8 h的皮内渗透率
针对重组胶原蛋白皮肤渗透性测试，中国抗衰老促进会在2023年9月发布了《T/ZGKSL 010-2023 重组胶原蛋白透皮吸收测定方法》团体标准[6]。此文件给出了用于重组胶原蛋白透皮吸收的定性分析方法—荧光标记法和定量分析方法—扩散池法。
异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocyanate，FITC)被广泛用于在蛋白质氨基上附加荧光标签。当FITC在碱性溶液中与蛋白质反应时，异硫氰酸酯基团与蛋白游离的伯氨基反应，形成FITC-蛋白质结合物，在荧光灯源紫外线或蓝紫光激发下产生黄绿色荧光。将荧光标记好的胶原蛋白施加于离体皮肤上进行一定时间的渗透，取使用部位的离体皮肤进行冷冻切片。通过在荧光显微镜下观察对相应蛋白进行定性、定位分析。
图3. FITC荧光标记重组胶原蛋白渗透示意图
化学品皮肤吸收体外试验方法是模拟受试物在皮肤中的分布和吸收。通过添加供给液和收集接收液分别模拟涂抹供试品后皮上及皮下组织对供试品的吸收状态，考察供试品在不同时间点渗透进入皮肤的情况。
由于试验的待测供试品为重组胶原蛋白，而猪皮本身含有胶原蛋白，在经过不同时间点测试后，接收液中可能会含有猪皮来源胶原蛋白，需设置空白对照，如生理盐水。利用Franz 扩散池渗透实验收集猪皮表面、皮肤内部和接收液中的供试品样品，并以HPLC或依据《中华人民共和国药典》四部通则0731蛋白质含量测定法进行检测，确定重组胶原蛋白渗入猪皮各层的含量从而计算透皮吸收率，进行定量分析。
图4. Franz扩散池示意图[1]（图片引自原文）
除《T/ZGKSL 010-2023 重组胶原蛋白透皮吸收测定方法》列出的两种测定方法外，目前拉曼光谱、二次谐波、双光子等光谱技术也应用到了重组胶原蛋白皮肤渗透性的定性、定位的在体研究中。
科学的透皮吸收评价方法能为研发者提供有力依据和指导，对于推动重组胶原蛋白的创新研发和应用也至关重要。
参考文献
[1]宋艳青,盘瑶,赵华.化妆品透皮吸收试验方法概述[J].日用化学工业,2019,49(12):824-829.
[2] Bos J D, Meinardi MMHM. The 500 Dalton rule for the skin penetration of chemical compounds and drugs[J]. Experimental Dermatology: Viewpoint, 2000, 9(3): 165-169.
[3]周建烈.水解胶原蛋白的美容效应研究进展[J]. 中国美容医学,2010,11(19): 1730-1731.
[4] Chang L, Fan D D, Duan Z G, et al. The transdermal absorption study of human-like collagen[J]. Advanced Materials Research, 2012, 415: 1781-1785.
[5]孙娅楠,赵静.二次谐波结合双光子荧光成像方法观察人源胶原蛋白透皮吸收情况[J].激光生物学报,2017,26(01):24-29.
[6]《T/ZGKSL 010-2023 重组胶原蛋白透皮吸收测定方法》