质粒提取实验常见问题，专业解答来啦！
质粒提取实验常见问题，专业解答来啦！
质粒提取实验是实验室常见的操作之一，但要做好这项实验并非易事。从菌液培养到最终的质粒提取，每一个环节都需要精心把控。本文将为您详细解答质粒提取实验中常见的问题，帮助您提高实验成功率。
1. 菌液培养时间多久合适?
细菌培养时间建议不要超过16小时，菌液OD值在2.5-2.6左右为佳。培养时间短会导致菌体生长不充分，而培养时间过长则会导致菌体死亡，这些都会影响收集的菌体量，从而影响抽提出的质粒DNA的量。在接菌前，可以将保存的菌种先进行活化，然后再接菌，这样可以使过夜培养的菌液生长更充分。在一定范围内增加菌体量，可以提高所提质粒的浓度。
2. 如何选择适合的质粒提取试剂盒?
根据提取菌液量的大小，质粒提取试剂盒可分为四类：质粒小提（1-5mL）、质粒小提中量（5-15mL）、质粒中大提（15-50mL）和质粒大提（50-300mL）。每一类中还可根据是否需要去除内毒素来进一步划分。研究者可以根据不同的实验需求来选择相应的试剂盒。通常来说，对于常规的载体构建实验、测序需求，一般试剂盒都能达到要求；若后续做细胞转染实验则需选择去内毒素的质粒提取试剂盒。如不知道选择何种试剂品牌，则可以优先选择在提取试剂领域专业深耕，有产品口碑又有产品性能的品牌，如Qiagen、BIOG等。
3. 质粒转染后细胞出现死亡或转染效果差，从质粒本身分析，原因可能有哪些?
如果下游转染出现以上问题，从质粒本身来看，可能是因为：
未使用去内毒素的质粒提取试剂盒。内毒素可与质粒DNA竞争转染试剂，阻碍质粒DNA进入细胞，从而极大程度地影响转染效率；同时，由于转染试剂会使细胞膜的通透性增加，内毒素进入细胞，导致细胞活力降低甚至引起死亡，则会进一步影响转染效率。建议选用添加有高效含内毒素清除因子的质粒提取试剂，以高效清除提取质粒中残存的内毒素。鲎试剂测试表明，使用BIOG EndotoxinOUT 提取得到的质粒溶液，内毒素去除率可高达90%以上，可大幅提升细胞转染的效率。
质粒纯度不够。在常规质粒提取试剂中，碱裂解法最为常用，但要注意其操作过程中，动作必须尽量温和，否则基因组DNA会由于剧烈操作而被破坏成小片段，在中和过程中被复性，保留在上清中随质粒DNA一同被回收，不仅会导致分光光度计测定的质粒DNA浓度值虚高、影响质粒提取的纯度，还会影响后续的转染效率。因此，质粒提取后进行琼脂糖凝胶电泳就显得非常有必要，可检测质粒中是否含有残留的基因组DNA或RNA，便于研究者对质粒质量有更好的把控。
4. 质粒DNA产量低或提取失败的原因?
菌种活性不佳：如菌种保存时间过久，质粒可能丢失，建议培养前先划线活化，以稳定产量；如大肠杆菌太陈旧（低温下长期保存的菌等），建议重新涂板培养后挑选新菌落进行液体培养；
未充分裂解细菌：细菌需充分重悬，成团的细菌会因无法裂解降低产量；
裂解时间过长；
质粒本身拷贝数低。载体因拷贝数差异会造成质粒产量明显的波动。高拷贝数的载体常有2-3倍的产量波动（每毫升培养过夜的菌液产量为3-16μg）；长片段质粒和表达型载体常以中低拷贝数为主，每毫升菌液的产量约为0.5-2μg；低拷贝质粒可以增加起始菌液量来提高浓度；
菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。
5. 如何提高质粒提取的得率?
菌液样本量和提取试剂用量比例合理。质粒提取过程中，并非菌体量越高提取产量越高，投入过多的菌液，会导致菌体裂解不充分，在适合范围内增加菌液量并适当添加提取试剂的使用量，两者比例合理，以能够充分裂解为佳，可提高质粒提取得率。
彻底裂解菌体细胞壁。建议选用含有高效菌体裂解酶的质粒提取试剂，如BIOG系列质粒提取试剂，组分溶液Ⅱ中内置专研高效裂解酶，可充分降解细胞壁中的肽聚糖和蛋白质，使DNA释放到溶液中，提高质粒提取得率。
选择吸附能力强的吸附膜。吸附膜虽不太受研究者关注，但国产和进口吸附膜在吸附性能上仍有一点差距。目前，进口化学修饰离子膜比一些国产膜要更薄一点，但吸附能力超越普通的膜。据了解除了像Qiagen这类国外大牌试剂，国内百代生物也已采用进口美产离子膜，使用这类膜进行提取对于质粒得率的提升具有更加显著的效果。