考马斯亮蓝法：蛋白质含量测定的实用指南
考马斯亮蓝法：蛋白质含量测定的实用指南
考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质含量测定方法，具有灵敏度高、操作简便、干扰物质少等优点。该方法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250的定量结合反应，通过测定595nm处的吸光度来计算蛋白质含量。本文将详细介绍考马斯亮蓝法的原理、实验步骤和注意事项，帮助科研人员准确测定蛋白质含量。
原理
考马斯亮蓝显色法的基本原理是根据蛋白质可与考马斯亮蓝G-250 定量结合。当考马斯亮蓝 G-250 与蛋白质结合后，其对可见光的最大吸收峰从 465nm 变为 595nm。在考马斯亮蓝 G-250 过量且浓度恒定的情况下，当溶液中的蛋白质浓度不同时，就会有不同量的考马斯亮蓝 G-250 从吸收峰为 465nm 的形式转变成吸收峰为 595nm 的形式，而且这种转变有一定的数量关系。一般情况，当溶液中的蛋白质浓度增加时，显色液在 595nm 处的吸光度基本能保持线性增加，因此可以用考马斯亮蓝 G-250 显色法来测定溶液中蛋白质的含量。
材料与仪器
- 蛋白质样品
- 牛血清
- NaCl
- 考马斯亮蓝
- 分光光度计
- 离心机
步骤
一、试剂与器材
- 试剂
- （1） 标准蛋白质溶液，用 G-球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0 mg/ml和0.1 mg/ml的标准蛋白质溶液。
- （2） 考马斯亮兰G-250染料试剂：称100 mg考马斯亮兰G-250，溶于50 ml 95%的乙醇后，再加入120 ml 85%的磷酸，用水稀释至1 L。
- 器材
- 可见光分光光度计
- 旋涡混合器
- 试管16支
二、操作方法
- 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 ml，然后用无离子水补充到0.1 ml。最后各试管中分别加入5.0 ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
（2） 加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1 ml H2O加5.0 ml G-250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
考马斯亮兰法实验表
（3）用标准蛋白质量（mg）为横座标，用吸光度值A595为纵座标，作图，即得到一条标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。
0.5 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50。
微量法
当样品中蛋白质浓度较稀时（10-100 mg/ml），可将取样量（包括补加的水）加大到0.5 ml或1.0 ml，空白对照则分别为0.5 ml或1.0 ml H2O， 考马斯亮蓝G-250试剂仍加5.0 ml，同时作相应的标准曲线，测定595 nm的光吸收值。
0.05 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.29。
注意事项
Bradford法比Lowry法要简单迅速，是测定蛋白质浓度的选用方法。有些物质会干扰这种检测反应，它们是甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、和一些碱性缓冲系统。用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除大部分这些干扰物质的影响。
常见问题
一、Bradford法的突出优点
- 灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1 mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。
- 测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。
- 干扰物质少。如干扰lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
二、Bradford法的缺点
- 由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 G-球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
- 仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Ttriton x-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1 N的氢氧化钠。（如同0.1 N的酸干扰lowary法一样）。
- 标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。