考马斯亮蓝法测蛋白质含量

考马斯亮蓝法测蛋白质含量

考马斯亮蓝法是一种常用的蛋白质定量测定方法，具有操作简便、灵敏度高、反应迅速等特点。本文将详细介绍该方法的实验原理、所需材料和具体操作步骤，帮助读者掌握这一重要的生物化学实验技术。

实验目的

学习和掌握考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量的原理和方法。

实验原理

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

材料、主要仪器和试剂

1. 实验材料

• 新鲜绿豆芽

2. 主要仪器

• 分析天平、台式天平
• 刻度吸管
• 具塞试管、试管架
• 研钵
• 离心机、离心管
• 烧杯、量筒
• 微量取样器

3. 试剂

• 牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1000μg／mL的原液。
• 蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1000mL。此溶液在常温下可放置一个月。
• 乙醇
• 磷酸（85％）

操作步骤

1. 标准曲线制作

• 0~100μg／mL标准曲线的制作：取6支10mL干净的具塞试管，按表1取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min后用1cm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

表1 低浓度标准曲线制作

• 01000μg／mL标准曲线的制作：另取6支10mL具塞试管，按表2取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为01000μg／mL的标准曲线。

表2 高浓度标准曲线制作

2. 样品提取液中蛋白质浓度的测定

• 待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g放入研钵中，加2mL蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h以充分提取，然后在4000r/min离心20min，弃去沉淀，上清液转入10mL容量瓶，并以蒸馏水定容至刻度，即得待测样品提取液。
• 测定：另取2支10mL具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.1mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋白试剂，充分混合，放置2min后用1cm光径比色杯在595nm下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1号试管做空白。

结果计算

式中：X为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。

附注

1. Bradford法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
2. 有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS等严重干扰测定。
3. 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。